PCR检验质量控制课件

PCR检验质量控制主讲人：姜锐ppt课件PCR检验质量控制主讲人：姜锐ppt课件实验室设置要求四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区）必须是互相独立的各区间不能直通，应有缓冲间应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调设备(不能使用中央空调)

标本制备区有生物安全柜、冲眼器除移动紫外灯外，各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯传递窗ppt课件实验室设置要求四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物传递窗传递窗ppt课件传递窗传递窗ppt课件

实验室管理进入和使用实验室各区域应有明确的限制和控制，防止患者和其他非相关人员的随意进出不同工作区域内的设备、物品不得混用ppt课件实验室管理进入和使用实验室各区域应有明确的限制和控制，防止临床基因扩增检验质量控制分析前—患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医生报告单申请分析中—样本分样、仪器、核酸提取、核酸扩增、产物分析、检测的有效性判断分析后—试验报告、报告传递、结果的接收、结果的审核、结果解释ppt课件临床基因扩增检验质量控制分析前—患者准备、标本（采集、运送、标本标本采集时间对扩增检测结果的影响标本的类型和采集量采样及运输容器采样质量的评价标本采集中的防污染ppt课件标本标本采集时间对扩增检测结果的影响ppt课件

标本采集时间1、血清（浆）：无特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT项目：应在抗生素应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集3、如用痰做TB：应在抗结核药物应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。

ppt课件标本采集时间1、血清（浆）：无特殊要求ppt课件标本采集量标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。血浆：HBV,HCV全血：EB生殖道分泌物：CT痰液，肺泡灌洗液：TBppt课件标本采集量标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。ppt课件采样容器采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是Taq酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难完全去除。

使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase永久性失活。ppt课件采样容器采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过标本验收、拒收血液标本：溶血、严重脂血等应拒收泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般<10个，白细胞一般>25个。ppt课件标本验收、拒收血液标本：溶血、严重脂血等应拒收ppt课件标本运送实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后8h之内送至实验室；靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验室；所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放2－8℃临时保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。

ppt课件标本运送实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条标本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）靶核酸为DNA的标本2-8℃保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应－20℃下保存－20℃下保存1个月－70℃以下可长期保存如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于TE缓冲液2-8℃下保存。用于RNA扩增分析的样本，则应于上述TE缓冲液中-70℃保存。

ppt课件标本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因标本接收标本接收建议在三个测定区之外接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性ppt课件标本接收标本接收建议在三个测定区之外ppt课件标本处理

血清（浆）：应1小时内分离血清，抗凝后4小时内分离血浆，然后转移至1.5ml灭菌离心管中保存。若血清分离不充分，可1500rpm离心5min。如甘油三酯含量超过6mmol/L或肉眼可见血清/血浆呈白色浑浊状的标本，应4℃13000rpm离心15min,吸取下层清亮血清或血浆转移至1.5ml灭菌离心管中保存泌尿生殖道分泌物一次性采样管（含保养液）配套棉拭子（不含保养液）痰液结核分枝杆菌DNA检测标本：用4%NaOH摇匀，室温下放置30分钟左右液化，转移至1.5ml灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化时不能加热，液化时间不能过长。非结核分枝杆菌DNA检测标本：痰标本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切记不能用NaOH液化痰标本。

ppt课件标本处理血清（浆）：ppt课件实验室仪器设备分册建立仪器档案定期维护保养定期校准或检定（校准周期、校准单位、校准参数、合格的校准报告）使用前后清洁：75%乙醇擦拭,不得用次氯酸钠溶液清洁，使用前后紫外线照射ppt课件实验室仪器设备分册建立仪器档案ppt课件耗材、试剂耗材：带滤芯或者高压灭菌吸头，EP管试剂盒的质检：包括外观质检和性能质检选择或更换试剂品牌：试剂性能评估更换试剂批号：评价核酸提取效率和扩增效率ppt课件耗材、试剂耗材：带滤芯或者高压灭菌吸头，EP管ppt课件试剂质检设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照试剂不合格

1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。

3)阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。

4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。试剂合格阴性对照无扩增、低值阳性质控品检出ppt课件试剂质检设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照ppt课件质控品来源及使用来源:第三方、试剂盒自带、自备使用:1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量；当溶剂为焦碳酸二乙酯（DEPC）水时，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。因DEPC是一种潜在的致癌物质.它可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制物。

2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确

3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇ppt课件质控品来源及使用ppt课件质控品设置、数量

定性检测已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，监测核酸提取和扩增检测的有效性已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，判断核酸提取过程中是否发生污染(实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染定量检测已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）ppt课件质控品设置、数量定性检测ppt课件质控品位置室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可能监测每一个孔扩增有效性板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。ppt课件质控品位置室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可质控品均值建立暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少在5d内，每天作不少于4次重复检测获得20个数值。对数据进行离群值检验（剔除超过3s外的数据），计算出均值，作为暂定均值。若使用定值质控品，均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。常规均值的建立：以最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，并以此作为以后室内质控图的均值。ppt课件质控品均值建立暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少常用质控规则的符号及定义符号定义12S

一个质控测定值超出±2s控制限。13S

一个质控测定值超出±3s控制限。22S

两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限。R4S

同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限。41S

四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限。10X

十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。ppt课件常用质控规则的符号及定义符号统计质控方法Levey-Jennings质控图方法

Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法

ppt课件统计质控方法Levey-Jennings质控图方法ppt课Levey-Jennings质控图方法根据常规条件下的变异（RCV）计算中的平均值和SD确定质控线，一般以X±2S为告警限，X±3S为失控限，将所得质控结果标在一张质控图上，简单明了。但如果以X±2S为失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X±3S为失控限假失控概率低，但误差检出能力不强。ppt课件Levey-Jennings质控图方法根据常规条件下的变由12S，13S

，22S

，R4S

，41S

，10等规则组成，其中既有对随机误差检出敏感的，也有对系统误差敏感的。结合在一起，假失控和假告警概率低，误差检出能力增强，大大提高了失控的检出率。在实践中13s

、R4s规则常检出随机误差，而22s

、41s和10x质控规则检出系统误差。

Westgard多规则控制方法ppt课件由12S，13S，22S，R4S，41S，101)12S

为警告规则，不是失控规则。 若本批检验没有出现控制结果超出控制线，表示本批结果没有问题，在控，可以发出报告。 若本批检验有1个控制结果超出（不包括正好在限值线上的结果）2S控制线，表示本批结果可能有问题，符合12S规则。是一个警告，但不是失控。ppt课件1)12S为警告规则，不是失控规则。ppt课件12S12S规则示意图ppt课件12S12S规则示意图ppt课件

失控的表现如下：

2）13S

即这个控制值不仅超出2S控制线（符合12S规则），而且还超出了3S限值（符合13S规则）。这是在检验中很少发生的（概率约为0.3%），是一个检出随机误差的失控规则。ppt课件 失控的表现如下：ppt课件13S失控规则13S失控规则示意图ppt课件13S13S失控规则示意图ppt课件3）22S

有两种表现：l同批两个控制品结果同方向超出2S限值。或同一控制品连续两批控制结果同方向超出2S限值。 属系统误差失控。ppt课件3）22S有两种表现：ppt课件22S失控规则22S失控规则示意图22S失控规则ppt课件22S22S失控规则示意图22Sppt课件

4）R4S

在同一批中两个控制结果差超出4S范围，其中有一个超出了+2S限值，另一个超出了2S限值。或其中一个超出了＋1.5S，另一个超出了－2.5S限值属随机误差过大，为失控。ppt课件

4）R4S在同一批中两个控制结果差超出4S范围，其R4S失控规则R4S失控规则示意图ppt课件R4SR4S失控规则示意图ppt课件5）41S

有两种表现：包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前3次结果均和这个控制结果在同方向超出+1S或1S范围。l

包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前1次结果，均同方向超出+1S或1S范围；另一个控制品的这两次结果也是同方向超出+1S或1S范围。 属系统误差失控。ppt课件5）41S有两种表现：ppt课件41S失控规则41S失控规则41S失控规则示意图ppt课件41S41S41S失控规则示意图ppt课件

6）10连同出现12S警告的这个结果，另外还有两个控制品的结果，在前几批及本批结果中，有连续10次在 的一侧。 属系统误差失控。ppt课件6）10连同出现12S警告的这个结果，另外还有两个控

失控规则示意图失控规则ppt课件失控规则示意图失控规则ppt课件失控原因分析—阳性质控样本常见的失控原因核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。ppt课件失控原因分析—阳性质控样本常见的失控原因核酸提取中的随机误差失控原因分析—阴性质控样本的失控原因扩增产物的“污染”

临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉“污染”.ppt课件失控原因分析—阴性质控样本的失控原因扩增产物的“污染”pp避免基因扩增检验假阳性结果的措施严格的实验室分区使用带“滤芯”的吸头设立“阴性”质控（与标本同时处理）使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。ppt课件避免基因扩增检验假阳性结果的措施严格的实验室分区ppt课件避免基因扩增检验假阴性结果的措施避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准ppt课件避免基因扩增检验假阴性结果的措施避免由于来自于标本的血红蛋白注意事项在PCR试剂准备区配置反应混合液配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解优先选择含UNG的试剂盒试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌标本处理应在标本制备区指定的生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心ppt课件注意事项在PCR试剂准备区配置反应混合液ppt课件注意事项如遇吸弃上清步骤的提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应做到处理时间充分，保证标本中的DNA或RNA完全释放；将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按生物污染废弃物进行处理。扩增条件一致的不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包好远离PCR实验室的洗涤间消毒处理；工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁ppt课件注意事项如遇吸弃上清步骤的提取方法，离心时应注意离心管的方向结果判断在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。基线值（阈值）设定：遵从厂商规定ppt课件结果判断在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后仪器基线设定在阴性对照线上与所有扩增曲线相交相交点在曲线的平滑区ppt课件仪器基线设定在阴性对照线上ppt课件实验结果有效性判断标准标准曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数等参数的数值允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效，全部标本应重新检测。ppt课件实验结果有效性判断标准标准曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数实验灰区标本的处理定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。CT：38≤Ct值<40为检测灰区，建议重复检测2次。如果检测结果至少1次为Ct<40判断为阳性，否则判为阴性。ppt课件实验灰区标本的处理定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次结果报告定性检测定性检测的结果报“阴性”或“阳性”。但由于目前国内商品试剂盒的灵敏度多为500-1000IU/ml，在报告结果时应告知临床医生方法的局限性。定量检测

1）结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告。

2）样本未出现扩增曲线，则报告为“低于检测下限”，不能报告为“0”或“阴性”。如果低于检测下限，但又有扩增曲线，则应重新检测，仍低于检测下限，则报告为“低于检测下限”。

3）结果高于检测上限，则报告“高于检测上限”，如果需要精确定量结果，则应用阴性血清（浆）将样本进行100-1000倍稀释后再重新进行检测，结果乘上稀释倍数；或将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。ppt课件结果报告定性检测定性检测的结果报“阴性”或“阳性”。但由于结果解释临床可以肺结核患者痰涂片阴性，而TB菌PCR阳性或时阴时阳，可能患者为初起病间断排菌且排菌量不大所致；或经抗结核治疗后，常有矛盾报告[培养（-）、PCR（+）较多]，因为只要有TB靶片段存在，PCR即可阳性，而测得阳性，不一定有活菌，加之病情与菌量不一定成正比。HBV（及HCV）感染在抗病毒治疗过程中，可出现HBV-DNA(及HCV-RNA)阴转情况，有时停药后又转阳。药物是否能彻底清除病毒还要根据肝脏酶学、病毒血清学标志物及核酸结果综合考虑，仅有核酸阴转而其他指标不改变并不能证明临床痊愈。另外，PCR检测结果阴性并不能排除样本含有病原体，只能说明含有的病原体浓度低于本试剂的检测下限

ppt课件结果解释临床可以肺结核患者痰涂片阴性，而TB菌PCR阳性或时

谢谢ppt课件谢谢ppt课件PCR检验质量控制主讲人：姜锐ppt课件PCR检验质量控制主讲人：姜锐ppt课件实验室设置要求四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区）必须是互相独立的各区间不能直通，应有缓冲间应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调设备(不能使用中央空调)

标本制备区有生物安全柜、冲眼器除移动紫外灯外，各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯传递窗ppt课件实验室设置要求四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物传递窗传递窗ppt课件传递窗传递窗ppt课件

实验室管理进入和使用实验室各区域应有明确的限制和控制，防止患者和其他非相关人员的随意进出不同工作区域内的设备、物品不得混用ppt课件实验室管理进入和使用实验室各区域应有明确的限制和控制，防止临床基因扩增检验质量控制分析前—患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医生报告单申请分析中—样本分样、仪器、核酸提取、核酸扩增、产物分析、检测的有效性判断分析后—试验报告、报告传递、结果的接收、结果的审核、结果解释ppt课件临床基因扩增检验质量控制分析前—患者准备、标本（采集、运送、标本标本采集时间对扩增检测结果的影响标本的类型和采集量采样及运输容器采样质量的评价标本采集中的防污染ppt课件标本标本采集时间对扩增检测结果的影响ppt课件

标本采集时间1、血清（浆）：无特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT项目：应在抗生素应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集3、如用痰做TB：应在抗结核药物应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。

ppt课件标本采集时间1、血清（浆）：无特殊要求ppt课件标本采集量标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。血浆：HBV,HCV全血：EB生殖道分泌物：CT痰液，肺泡灌洗液：TBppt课件标本采集量标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。ppt课件采样容器采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是Taq酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难完全去除。

使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase永久性失活。ppt课件采样容器采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过标本验收、拒收血液标本：溶血、严重脂血等应拒收泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般<10个，白细胞一般>25个。ppt课件标本验收、拒收血液标本：溶血、严重脂血等应拒收ppt课件标本运送实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后8h之内送至实验室；靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验室；所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放2－8℃临时保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。

ppt课件标本运送实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条标本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）靶核酸为DNA的标本2-8℃保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应－20℃下保存－20℃下保存1个月－70℃以下可长期保存如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于TE缓冲液2-8℃下保存。用于RNA扩增分析的样本，则应于上述TE缓冲液中-70℃保存。

ppt课件标本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因标本接收标本接收建议在三个测定区之外接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性ppt课件标本接收标本接收建议在三个测定区之外ppt课件标本处理

血清（浆）：应1小时内分离血清，抗凝后4小时内分离血浆，然后转移至1.5ml灭菌离心管中保存。若血清分离不充分，可1500rpm离心5min。如甘油三酯含量超过6mmol/L或肉眼可见血清/血浆呈白色浑浊状的标本，应4℃13000rpm离心15min,吸取下层清亮血清或血浆转移至1.5ml灭菌离心管中保存泌尿生殖道分泌物一次性采样管（含保养液）配套棉拭子（不含保养液）痰液结核分枝杆菌DNA检测标本：用4%NaOH摇匀，室温下放置30分钟左右液化，转移至1.5ml灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化时不能加热，液化时间不能过长。非结核分枝杆菌DNA检测标本：痰标本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切记不能用NaOH液化痰标本。

ppt课件标本处理血清（浆）：ppt课件实验室仪器设备分册建立仪器档案定期维护保养定期校准或检定（校准周期、校准单位、校准参数、合格的校准报告）使用前后清洁：75%乙醇擦拭,不得用次氯酸钠溶液清洁，使用前后紫外线照射ppt课件实验室仪器设备分册建立仪器档案ppt课件耗材、试剂耗材：带滤芯或者高压灭菌吸头，EP管试剂盒的质检：包括外观质检和性能质检选择或更换试剂品牌：试剂性能评估更换试剂批号：评价核酸提取效率和扩增效率ppt课件耗材、试剂耗材：带滤芯或者高压灭菌吸头，EP管ppt课件试剂质检设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照试剂不合格

1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。

3)阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。

4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。试剂合格阴性对照无扩增、低值阳性质控品检出ppt课件试剂质检设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照ppt课件质控品来源及使用来源:第三方、试剂盒自带、自备使用:1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量；当溶剂为焦碳酸二乙酯（DEPC）水时，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。因DEPC是一种潜在的致癌物质.它可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制物。

2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确

3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇ppt课件质控品来源及使用ppt课件质控品设置、数量

定性检测已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，监测核酸提取和扩增检测的有效性已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，判断核酸提取过程中是否发生污染(实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染定量检测已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）ppt课件质控品设置、数量定性检测ppt课件质控品位置室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可能监测每一个孔扩增有效性板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。ppt课件质控品位置室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可质控品均值建立暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少在5d内，每天作不少于4次重复检测获得20个数值。对数据进行离群值检验（剔除超过3s外的数据），计算出均值，作为暂定均值。若使用定值质控品，均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。常规均值的建立：以最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，并以此作为以后室内质控图的均值。ppt课件质控品均值建立暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少常用质控规则的符号及定义符号定义12S

一个质控测定值超出±2s控制限。13S

一个质控测定值超出±3s控制限。22S

两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限。R4S

同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限。41S

四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限。10X

十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。ppt课件常用质控规则的符号及定义符号统计质控方法Levey-Jennings质控图方法

Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法

ppt课件统计质控方法Levey-Jennings质控图方法ppt课Levey-Jennings质控图方法根据常规条件下的变异（RCV）计算中的平均值和SD确定质控线，一般以X±2S为告警限，X±3S为失控限，将所得质控结果标在一张质控图上，简单明了。但如果以X±2S为失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X±3S为失控限假失控概率低，但误差检出能力不强。ppt课件Levey-Jennings质控图方法根据常规条件下的变由12S，13S

，22S

，R4S

，41S

，10等规则组成，其中既有对随机误差检出敏感的，也有对系统误差敏感的。结合在一起，假失控和假告警概率低，误差检出能力增强，大大提高了失控的检出率。在实践中13s

、R4s规则常检出随机误差，而22s

、41s和10x质控规则检出系统误差。

Westgard多规则控制方法ppt课件由12S，13S，22S，R4S，41S，101)12S

为警告规则，不是失控规则。 若本批检验没有出现控制结果超出控制线，表示本批结果没有问题，在控，可以发出报告。 若本批检验有1个控制结果超出（不包括正好在限值线上的结果）2S控制线，表示本批结果可能有问题，符合12S规则。是一个警告，但不是失控。ppt课件1)12S为警告规则，不是失控规则。ppt课件12S12S规则示意图ppt课件12S12S规则示意图ppt课件

失控的表现如下：

2）13S

即这个控制值不仅超出2S控制线（符合12S规则），而且还超出了3S限值（符合13S规则）。这是在检验中很少发生的（概率约为0.3%），是一个检出随机误差的失控规则。ppt课件 失控的表现如下：ppt课件13S失控规则13S失控规则示意图ppt课件13S13S失控规则示意图ppt课件3）22S

有两种表现：l同批两个控制品结果同方向超出2S限值。或同一控制品连续两批控制结果同方向超出2S限值。 属系统误差失控。ppt课件3）22S有两种表现：ppt课件22S失控规则22S失控规则示意图22S失控规则ppt课件22S22S失控规则示意图22Sppt课件

4）R4S

在同一批中两个控制结果差超出4S范围，其中有一个超出了+2S限值，另一个超出了2S限值。或其中一个超出了＋1.5S，另一个超出了－2.5S限值属随机误差过大，为失控。ppt课件

4）R4S在同一批中两个控制结果差超出4S范围，其R4S失控规则R4S失控规则示意图ppt课件R4SR4S失控规则示意图ppt课件5）41S

有两种表现：包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前3次结果均和这个控制结果在同方向超出+1S或1S范围。l

包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前1次结果，均同方向超出+1S或1S范围；另一个控制品的这两次结果也是同方向超出+1S或1S范围。 属系统误差失控。ppt课件5）41S有两种表现：ppt课件41S失控规则41S失控规则41S失控规则示意图ppt课件41S41S41S失控规则示意图ppt课件

6）10连同出现12S警告的这个结果，另外还有两个控制品的结果，在前几批及本批结果中，有连续10次在 的一侧。 属系统误差失控。ppt课件6）10连同出现12S警告的这个结果，另外还有两个控

失控规则示意图失控规则ppt课件失控规则示意图失控规则ppt课件失控原因分析—阳性质控样本常见的失控原因核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。ppt课件失控原因分析—阳性质控样本常见的失控原因核酸提取中的随机误差失控原因分析—阴性质控样本的失控原因扩增产物的“污染”

临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉“污染”.ppt课件失控原因分析—阴性质控样本的失控原因扩增产物的“污染”pp避免基因扩增检验假阳性结果的措施严格的实验室分区使用带“滤芯”的吸头设立“阴性”质控（与标本同时处理）使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。ppt课件避免基因扩增检验假阳性结果的措施严格的实验室分区ppt课件避免基因扩增检验假阴性结果的措施避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准ppt课件避免基因扩增检验假阴性结果的措施避免由于来自于标本的血红蛋白注意事项在PCR试剂准备区配置反应混合液配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解优先选择含UNG的试剂盒试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌标本处理应在标本制备区指定的生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-10min，待柜内空气净化