凝胶过滤层析课件

第三章凝胶过滤层析第三章凝胶过滤层析第一节凝胶层析的基本原理第二节

凝胶介质的分类和性质第三节凝胶层析的基本操作第四节应用第一节凝胶层析的基本原理第二节凝胶介质的分类和性第一节凝胶层析的基本原理第一节凝胶层析的基本原理葡聚糖凝胶颗粒示意图

概念

凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析、立体排阻层析、体积排阻层析，是利用具有立体网状结构、且呈珠状颗粒的凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。葡聚糖凝胶颗粒示意图概念1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断地完善和发展。1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物交凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点。因此，广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作原理1)相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙向前移动，速度快而首先流出层析柱，因此流程较短；2)相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，从一个胶粒孔隙进入另一凝胶颗粒，移动速率慢而最后流出层析柱；3)中等大小的分子，在凝胶颗粒内外均有分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。原理凝胶过滤原理示意图凝胶过滤原理示意图

凝胶层析的几个概念外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积（Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

凝胶层析的几个概念外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周计算法：Vt=1/4D2h测量法：Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

由于Ｖｇ非常小，可忽略不计，因此：Ｖt＝Ｖ０+ＶｉＶ０可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如蓝色葡聚糖-2000；Ｖi可用硫酸铵等无吸附力的小分子物质。计算法：测量法：分配系数Ｋav

分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt－Vo)它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数与柱的物理条件无关。分配系数Ｋav

分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓（1）Ｋav=0时,Ve=Vo,意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相分布为0,而最先流出。（2）当Ｋav=1时,Ve=Vt,意味着该分子完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的比值为1,而最后流出.（3）当0<Ｋav<1,Vo<Ve<Vt为处于两种极端行为之间的分子。（4）Ｋav>1，Ve>Vt,说明凝胶对组分有吸附作用,此时例如一些芳香族化合物的洗脱体积远远超出理论计算的最大值.（1）Ｋav=0时,Ve=Vo,意味着该分子完全被排

因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小到大的顺序决定了物质流出的顺序。因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小到大的顺序决定了排阻极限：是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。

排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量。排阻极限：是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。分级分离范围

分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围。

对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。

例如SephadexG-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过SephadexG-75得到较好的分离。分级分离范围

分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围吸水率和床体积

吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。吸水率和床体积

吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或凝胶颗粒大小

层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（

μm）来表示。凝胶颗粒大小决定柱子的分辨率和流速。凝胶颗粒大小

层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通交联度交联剂占单体和交联体总量的百分数凝胶颗粒孔径大小与交联度有关交联度第二节

凝胶介质的分类和性质第二节凝胶介质的分类和性质1）葡聚糖凝胶

①G类葡聚糖（Sephadex）

②LH-亲脂型葡聚糖

③

Sephacryl2）琼脂糖凝胶3）聚丙烯酰胺凝胶1）葡聚糖凝胶（1）葡聚糖凝胶①G类葡聚糖（Sephadex）

由葡聚糖和环氧氯丙烷交联剂以醚键交联而成理化性质

1）交联度不同，型号不同，膨胀度和吸水量不同，孔径大小和分级范围也不同；

2）商业用的型号又G10、G15、G25，G100等，数字代表每g干凝胶吸水量×10，如G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升；3）数字越小，分级范围窄，适合低分子量的蛋白质的分离，数字越大，适合宽范围分子量的分级（1）葡聚糖凝胶①G类葡聚糖（Sephadex）4）稳定性对碱比较稳定，在强酸性环境中其糖苷键易水解5）吸附性对碱性蛋白有吸附作用，提高离子强度即可解决（含NaCl的缓冲液）

4）稳定性

②LH-亲脂型葡聚糖

在Sephadex引入羟丙基基团，在有机溶剂中膨胀，可以分离脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、激素类等亲脂性分子的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。②LH-亲脂型葡聚糖

③Sephacryl

烯丙烷基葡聚糖和甲叉双丙稀酰胺交联而成。优点1）分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。甚至可以分离较大的病毒颗粒。2）化学稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温。3）机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，流速可以快些，分辨率也较高。

③Sephacryl（2）琼脂糖凝胶商品名Sepharose（瑞典）

1）琼脂糖与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖，稳定性提高；

2）型号2B,4B，数字代表颗粒中琼脂糖的百分含量，数字越大，分离的范围越小Bio－gelA(美国）

一般有A0.5,A1.5等型号，数字×106代表分离的分子量极限；与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些。（2）琼脂糖凝胶商品名Sepharose（瑞典）琼脂糖凝胶的优点和缺点优点

琼脂糖凝胶（agarosegel）比葡聚糖凝胶和生物胶的排阻范围大，可达相对分子质量108，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒；机械性能好。缺点不耐酸碱，最好将条件控制在pH4～9之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。琼脂糖凝胶的优点和缺点优点（3）聚丙烯酰胺凝胶商品名Bio－gel

丙烯酰胺与甲叉双丙稀酰胺交联，过硫酸铵为催化剂，TEMED加速剂。改变交联剂的浓度，可以改变孔隙，交联剂越多，孔隙越小；常用型号P-2和P－300，数字×103为分离的分子量极限聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-GelP-300为4×105

性质耐酸，pH1－10稳定，耐受变性剂（尿素、胍盐等）（3）聚丙烯酰胺凝胶商品名Bio－gel种类（商品名）商品型号型号中数字意义排阻限度稳定性葡聚糖凝胶（Sephadex）G15，G25，G100…每g的吸水量(ml)×10数字越大，筛孔越大

6×105水、盐、碱、弱酸中稳定；对强酸敏感琼脂糖凝胶（Sepharose）2B,4B,6B…颗粒中琼脂糖的含量（％）；数字越大，筛孔越小

1×108

机械强度好，物理稳定性高于葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶，但不耐酸碱（仅在ph4-9稳定）琼脂糖凝胶（Bio－gel）A0.5m，A5M…排阻极限*的10－6,数字越大，筛孔越大聚丙烯酰胺凝胶（Bio－gel）P-2,P-4,P-300…排阻极限*的10-3数字越大，筛孔越大

4×105耐受盐、尿素、胍盐，pH1－10稳定，短时超过此范围也可

几种凝胶的比较种类（商品名）商品型号型号中数字意义排阻限度稳定性葡聚糖凝胶第三节凝胶层析基本操作第三节凝胶层析基本操作一、凝胶的选择凝胶型号的选择凝胶粒度的选择不同凝胶类型的选择凝胶用量的计算一、凝胶的选择

组别分离，将样品中的大分子物质与小分子物质分开。脱盐就是一种组别分离。

其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。

分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。

策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。1）凝胶型号的选择（根据分离的目的）组别分离，将样品中的大分子物质与小分子物质分开。脱盐就是一

组别分离一般选用SephadexG-25或G-50(3*104Da)，脱盐一般选用G25（1000-5000Da）。

分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子量物质的凝胶。

分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子量2）粒度的选择

目数（反映凝胶颗粒直径的大小）。目数越大，直径越小。每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢，适合小型实验。层析柱选用大直径的；粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验，选用小直径的柱子提高分辨率。2）粒度的选择

凝胶粒度与洗脱效果的关系图凝胶粒度与洗脱效果的关系图3）不同凝胶类型的选择琼脂糖凝胶、Sephacryl

LH-葡聚糖凝胶琼脂糖凝和Sephacryl大分子分离亲脂分子规模大，流速快其他因素如洗脱液的酸碱度根据各种凝胶的性质选择3）不同凝胶类型的选择大分子分离亲脂分子规模大，流速快其他因4）凝胶用量的计算4）凝胶用量的计算二、凝胶的处理将所用的干凝胶慢慢倾入5、10倍的蒸馏水中，参照凝胶说明书溶胀所需的时间进行充分浸泡，并除去悬浮的小颗粒。再用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液在室温下浸泡0.5h，抽滤除去碱液．用蒸馏水洗至中性。为了除去凝胶颗粒空隙中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水或平衡液中用抽气方法实现。二、凝胶的处理三、凝胶柱的制备三、凝胶柱的制备1）柱的选择

长层析柱分辨效率高于短柱。理想的直径和长度之比是1：25－1：100根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内。1）柱的选择第三章--凝胶过滤层析课件2）装柱

干装法容易产生气泡湿装法先将适量溶剂加到柱中，将浸泡好的凝胶缓慢倒入，一直浸泡在溶剂中，沉降至柱高1/4－1/3时打开下端出口，溶剂流出。2）装柱3）鉴定柱的质量

用带色的物质或蛋白质过柱均匀下降即可。细胞色素c、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱。3）鉴定柱的质量第三章--凝胶过滤层析课件四、加样（1）加样体积越小，分辨率越高。两种蛋白洗脱体积为VeA、VeB，两种蛋白分离体积Vs（洗脱体积之差），Vs＝VeA-VeB,理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种蛋白质Vp<Vs时效果好。四、加样第三章--凝胶过滤层析课件（2）样品粘度的影响（2）样品粘度的影响五、洗脱洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或失活为原则。一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。五、洗脱第三章--凝胶过滤层析课件第三章--凝胶过滤层析课件影响流速的因素洗脱液加在柱上的压力凝胶交联度凝胶颗粒大小

影响流速的因素洗脱液加在柱上的压力流速过低样品横向扩散增大，峰变宽，分辨率降低，洗脱时间长流速过高洗脱峰重叠，柱压增大，分离效果变差线性流速控制在2～10cm/h流速过低第三章--凝胶过滤层析课件六、凝胶柱的再生和保存用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再使用。六、凝胶柱的再生和保存第三章--凝胶过滤层析课件第四节应用第四节应用脱盐高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中含有的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。脱盐时，选择排阻极限小的凝胶适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15脱盐分离大分子物质分离大分子物质测定分子量用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析记录每一种成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。LgMWVeve测定分子量LgMWVeveSephadexG-25层析柱脱盐

（1）凝胶的处理：量取100mLSephadexG-25（已溶胀好）入250mL烧杯中，加入200mL0.02mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲液，于沸水浴中加热1h。冷却后用真空干燥器脱气。SephadexG-25层析柱脱盐（1）凝胶的处理：量取（2）装柱：选用25×300mm层析柱，垂直夹与铁架台上。关闭层析柱出水口，然后在搅拌下将浆状的凝胶缓缓地倾入柱中，使之自然沉降，打开柱出水口，调节合适流速，使凝胶继续沉集。待沉集的胶面上升之距柱上口3～5cm时关闭层析柱出水口。（2）装柱：选用25×300mm层析柱，垂直夹与铁架台上。关（3）平衡：打开核酸蛋