LAMP技术及应用课件

LAMP技术及应用1LAMP技术及应用1LAMP技术简介

环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。2LAMP技术简介环介导等温扩增技术（Loop-medLAMP法和其他PCR法的比较3LAMP法和其他PCR法的比较3LAMP法和其他PCR法的比较4LAMP法和其他PCR法的比较4技术特点特异性高

4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PCR和qPCR灵敏度高

扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。检测时间短

恒温扩增，省却温度循环，扩增时间60min。设备简易，可同时检测多批样本

不需特定或高端检测仪器，恒温设备即可，例如水浴锅，可以随时放入后续批次样本。5技术特点特异性高

4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PLAMP法使用的酶链置换型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。6LAMP法使用的酶链置换型DNA聚合酶:BstDNAPLAMP法的引物设计7LAMP法的引物设计7LAMP法的原理8LAMP法的原理8LAMP法的原理9LAMP法的原理9LAMP法所需的试剂10LAMP法所需的试剂10LAMP法常规操作步骤11LAMP法常规操作步骤11LAMP法的检测方法琼脂糖凝胶电泳法由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。（图A）肉眼观察法在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）通过荧光染料检测有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBRGreenI等进行染色，来检测扩增是否发生。（图C）12LAMP法的检测方法琼脂糖凝胶电泳法12LAMP法的应用领域

食品领域・食物中毒致病菌的检测・食品的卫生管理・食物中毒的防止灵活运用LAMP法能够简单、快速地进行基因扩增的特征，LAMP技术在各个领域都得到广泛的应用。

临床领域・病原菌、病毒的检测及鉴定

农业领域・植物病害的早期发现

及蔓延防止・转基因作物的检测

环境领域・环境、水中病原微生物

的检测

工业领域・工业产品用大量

DNA的生产成为可能

畜牧业领域・雌雄性别判断・病原微生物的检测・遗传病的发现13LAMP法的应用领域食品领域灵活运用LALAMP法在结核菌检测中的应用靶标限定:结核分枝杆菌复合群临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌。对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本，长远来说，更有利于避免耐药性的产生。gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。14LAMP法在结核菌检测中的应用靶标限定:结核分枝杆菌复合LAMP法在结核菌检测中的应用适宜的检测对象

以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测对象，可避免假阳性过高。反应管预装反应体系

扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶污染；用户操作简便、减少操作误差。结果易读

产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。技术特点：15LAMP法在结核菌检测中的应用适宜的检测对象

以临床上引起结LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——

LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果灵敏度＝89.54%阳性结果预期值＝98.13%特异性＝98.93%阴性结果预期值＝93.77%总符合率＝95.31%16LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——LAMP法和对照LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——

LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果阳性一致率=88.56%阴性一致率=93.06%总符合率=91.36%17LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——LAMP法和对照LAMP法在结核菌检测中的应用现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较18LAMP法在结核菌检测中的应用现有结核诊断方法和环介导恒温扩一点建议•实验室严格PCR分区

–溶液配制区、样品处理区、检测区•基本操作

–混匀、吸取

–模板最后加入，按照先阴性、后阳性，从低到高梯度•环境污染

–UV照射

–DNAZAP等DNA降解试剂19一点建议•实验室严格PCR分区•基本操作•环境污染19谢谢!2020LAMP技术及应用21LAMP技术及应用1LAMP技术简介

环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。22LAMP技术简介环介导等温扩增技术（Loop-medLAMP法和其他PCR法的比较23LAMP法和其他PCR法的比较3LAMP法和其他PCR法的比较24LAMP法和其他PCR法的比较4技术特点特异性高

4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PCR和qPCR灵敏度高

扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。检测时间短

恒温扩增，省却温度循环，扩增时间60min。设备简易，可同时检测多批样本

不需特定或高端检测仪器，恒温设备即可，例如水浴锅，可以随时放入后续批次样本。25技术特点特异性高

4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PLAMP法使用的酶链置换型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。26LAMP法使用的酶链置换型DNA聚合酶:BstDNAPLAMP法的引物设计27LAMP法的引物设计7LAMP法的原理28LAMP法的原理8LAMP法的原理29LAMP法的原理9LAMP法所需的试剂30LAMP法所需的试剂10LAMP法常规操作步骤31LAMP法常规操作步骤11LAMP法的检测方法琼脂糖凝胶电泳法由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。（图A）肉眼观察法在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）通过荧光染料检测有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBRGreenI等进行染色，来检测扩增是否发生。（图C）32LAMP法的检测方法琼脂糖凝胶电泳法12LAMP法的应用领域

食品领域・食物中毒致病菌的检测・食品的卫生管理・食物中毒的防止灵活运用LAMP法能够简单、快速地进行基因扩增的特征，LAMP技术在各个领域都得到广泛的应用。

临床领域・病原菌、病毒的检测及鉴定

农业领域・植物病害的早期发现

及蔓延防止・转基因作物的检测

环境领域・环境、水中病原微生物

的检测

工业领域・工业产品用大量

DNA的生产成为可能

畜牧业领域・雌雄性别判断・病原微生物的检测・遗传病的发现33LAMP法的应用领域食品领域灵活运用LALAMP法在结核菌检测中的应用靶标限定:结核分枝杆菌复合群临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌。对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本，长远来说，更有利于避免耐药性的产生。gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。34LAMP法在结核菌检测中的应用靶标限定:结核分枝杆菌复合LAMP法在结核菌检测中的应用适宜的检测对象

以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测对象，可避免假阳性过高。反应管预装反应体系

扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶污染；用户操作简便、减少操作误差。结果易读

产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。技术特点：35LAMP法在结核菌检测中的应用适宜的检测对象

以临床上引起结LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——

LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果灵敏度＝89.54%阳性结果预期值＝98.13%特异性＝98.93%阴性结果预期值＝93.77%总符合率＝95.31%36LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——LAMP法和对照LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——

LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果阳性一致率=88.56%阴性一致率=93.06%总符合率=91.36%37LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——LAMP法和对照LAMP法在结核