基因表达的翻译调控课件

mRNA降解是转录后调控的一种方式

在真核细胞中，前体mRNA的加工与运输过程通常是同时进行的。成熟mRNA一旦进入胞浆，就有可能被降解。mRNA的运输和定位也是转录后调控的一种方式在胞浆内,mRNA翻译的分布是不均匀的,蛋白质的分布也是不均匀的。这不是因为蛋白质单纯扩散造成的，而是由于mRNA的运输和定位决定的。一般把对mRNA成熟、降解和胞浆内定位等翻译起始前过程的调控统称为转录后调控。

mRNA降解是转录后调控的一种方式1各种生物的蛋白质翻译体系大致相同：

mRNAtRNAcis-

核糖体蛋白质翻译体系酶系trans-

细胞因子其他小分子

翻译的过程主要包括三个阶段：翻译的起始、延伸和终止。各种生物的蛋白质翻译体系大致相同：2蛋白质翻译后的多种加工方式：修饰(modification)

折叠(folding)

分拣(sorting)

运输(traffiking)

定位(targeting)翻译水平上的调控机制大致可分为两种类型：

1.不受环境因素影响的。这种机制包含在基因的顺式结构中；

2.随环境因素变化而调节的。这种机制是反式作用的。翻译调控主要表现为翻译起始的调节。翻译调控的关键在于mRNA的结构。蛋白质翻译后的多种加工方式：35.1.翻译起始的调控

一个成熟的mRNA分子，其结构不仅包括氨基酸顺序的编码序列，而且也包括其5’和3’两端的非编码区(untranslatedregion,UTR)。因此，蛋白质的翻译不仅与mRNA的编码序列有关，而且受5’和3’UTR结构的控制。5.1.翻译起始的调控45.1.1.原核生物mRNA模板的核糖体结合序列

核糖体结合序列(RibosomeBindingSequence,RBS)是指起始密码AUG上游30－40碱基的一段UTR。RBS中有SD序列(Shine-Dalgarno,SD)。经计算机分析了74种原核生物的mRNA，认为SD序列为：5’-AAGGAGGU-3’八聚体，它和16SrRNA3’端的3’-AUCCUCCA-5’配对。其中GGAG是其核心。5.1.1.原核生物mRNA模板的核糖体结合序列55.1.2.真核生物mRNA的5’帽结构

所有真核生物mRNA5’端都有以5’-5’磷酸二酯键相连的帽结构m7GpppN。

1976年Shatkin就由体外试验结果发现，帽结构具有以下四个方面的作用：

1).

保护mRNA不被5’外切酶降解,增加mRNA稳定性；

2).

有利于mRNA从胞核向胞质的转运；

3).

有增强翻译的作用；大量体内和体外试验都证实，大多数mRNA的翻译活性依赖于帽结构。虽然未被甲基化的帽结构也能保护转录物不被5’外切酶核酸酶降解，但只有当它被甲基化后，才能被有效地翻译。

4).5’帽结构与3’poly(A)尾对mRNA翻译效率的调节有协同作用。

5.1.2.真核生物mRNA的5’帽结构6例外的情况：

属于小RNA病毒科(picornavirus)的(+)链RNA却没有5‘帽结构。例如：脊髓灰质炎病毒、脑-心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒和柯萨奇病毒(coxsackievirus)等。这些病毒侵入细胞后首先终止了宿主细胞的翻译，然后利用宿主细胞质中的核糖体进行以病毒RNA为模板的蛋白质合成。核糖体通过直接与病毒RNA5’UTR结构中的内部核糖体进入位点(InternalRibosome-entrySite,IRES)相结合，进行蛋白质的翻译。例外的情况：75.1.3.翻译起始密码的位置及其旁侧序列1).

AUG的位置根据资料分析表明，90－95％的真核mRNA的翻译启动开始于最靠近其5’端的第一个AUG密码。这就是第一AUG规律。如果在正常起始密码子上游再引入一个带最适旁侧序列的AUG密码时，会出现两种情况：如果新的阅读框架与原阅读框架不一致，结果会强烈抑制原有AUG的启动，而表现为新插入AUG的翻译作用；如果新插入的AUG与原有阅读框架保持一致，则新的AUG代替原来的起始密码，翻译产物包含原表达蛋白。5.1.3.翻译起始密码的位置及其旁侧序列8例外的情况：在高等真核细胞中，一些原癌基因和生长调节因子基因产生的mRNA5’UTR内往往有一个以上的AUG，其翻译起始作用并不遵循第一AUG规律。表明这些基因的表达存在翻译水平的调节。当某些mRNA5’UTR区中存在一个以上AUG密码时,其中只有一个AUG是主要读框的翻译起始位点。存在于它上游的其他AUG被称为“上游AUG”。这些上游AUG的存在往往抑制其下游读框的翻译效率。例如，酵母细胞中有正调控作用的转录调控因子GCN4，其mRNA5’UTR中含有四个ORF，这些ORFs对主要ORF的翻译有抑制作用。(童克中《基因表达》p268)

例外的情况：92).

AUG的旁侧序列

在翻译起始的调节中，除了AUG的位置具有重要性外，AUG的旁侧序列与翻译起始效率也有密切关系。在原核生物中，有人通过对大肠杆菌lacZ基因进行突变研究，结果证明AUG上游第一个三联体以UAU、CUU为最佳。而UUC、UUA或AGG则降低翻译效率20倍。此外,AGG易与SD序列混淆，应予避免。在真核生物中，M.Kozak于1987年通过对699种脊椎动物mRNA翻译起始密码AUG5‘和3’两侧核苷酸序列的分析，发现了一个共有序列(consensusesequence),也即理想的旁侧序列。2).AUG的旁侧序列10

Kozak对AUG起始密码两侧的核苷酸进行过系统的突变试验，发现－3位的A和＋4位的G对于AUG被起始识别具有显著的促进作用。如果－3位不是A，则＋4位的G对于有效的翻译起始是必须的。

1991年Cavener等对真核mRNA起始位点旁侧序列做了广泛的统计学分析，进一步证实了－3位的A是真核生物mRNA的普遍规律。并且发现-3,-2和-1位具有较强的三核苷酸倾向：脊椎动物最常见：ACC和GCC;

非脊椎动物最常见：AAA和ACA;

脊椎动物病毒：AAA。Kozak对AUG起始密码两侧的核苷酸进行过系统11真核基因mRNA起始密码旁侧的共有序列

共有序列物种-3-2-1+1+2+3+4脊椎动物GCCGCCACCAUGGG植物AAAAAUGGC果蝇UAAAAUG

A

C

酵母AAAAAAAUGUCU

UCC原生动物AAAAAAAAAAAAAUGA

UUUUUUUUU真核基因mRNA起始密码旁侧的共有序列125.1.4.翻译起始先导序列的长度(Leaderlength)

Kozak通过系统地构建和分析了一系列不同5‘UTR长度的转录体后发现,当5’UTR中第一个AUG离5’帽结构的位置太近时，不会被核糖体40S亚基识别。例如：当第一个AUG与5’帽结构间距在12个碱基以内时，尽管把起始密码置于理想的旁侧序列中，仍有一半以上的40S亚基会滑过第一个AUG，从其下游AUG起始翻译。当把间距增加到20个碱基长度时，可以防止核糖体滑过的现象。当间距在17－80个碱基之间时，体外翻译效率与其长度成正比。由此可见，先导序列的长度影响翻译起始的效率和翻译起始的准确性。

5.1.4.翻译起始先导序列的长度(Leaderle135.1.5.5‘-UTR高级结构的影响

当5’UTR中存在碱基配对区时，就可以形成茎环结构。这类结构会妨碍核糖体对mRNA起译部位的结合，阻止核糖体40S亚基的迁移，对翻译起始具有顺式阻抑作用。其阻抑作用的强弱取决于茎环结构的稳定性和其在5’UTR中的位置。

1).茎环结构的稳定性碱基配对区越长或GC对含量越高，发卡结构越稳定。

2).茎环结构在5’UTR中的位置

Kozak将有一定稳定性的茎环结构置于距5’

帽结构仅12碱基的位置上，结果核糖体40S亚基不能与mRNA结合，影响了翻译的起始。当他把这一结构置于距5’

帽结构52碱基位置时，就不影响核糖体对mRNA的结合与翻译的起始。这表明，虽然mRNA5’近端的二级结构能阻碍核糖体40S亚基及起始因子复合物与翻译模板的结合。但是，一旦形成这种结合后，起始复合物就有能力穿透二级结构区。这种穿透作用可能与某些起始因子具有解旋酶活力有关。5.1.5.5‘-UTR高级结构的影响14

茎环结构除了对翻译起始有阻抑作用外，在一定条件下，也能以正调节方式促进翻译起始过程。这种促进作用表现在两方面：

1).当一个处于非理想旁侧序列中的AUG，其下游适宜的邻近位置有茎环结构时，翻译作用可以从这个AUG开始。例如：通过试验把茎环结构分别置于非理想旁侧序列中的AUG密码下游不同距离处，观察这个AUG起始翻译的效率。结果发现，当茎环结构位于该AUG下游14个碱基的距离时，增强了它的翻译起始效率；而位于2个碱基或32个碱基时则没表现出这种促进作用。

2).下游茎环结构能激活处于理想旁侧序列中的非AUG起始密码的作用。现已发现某些天然mRNA的翻译作用起始于非AUG密码,例如：tK酪氨酸激酶的CUG;

小鼠int.2基因转录产物的CUG;

鼠p88Krox-24蛋白的ACG等等。原因就是这些mRNA5’UTR的GC丰富区形成茎环结构来促进其上游处于非理想旁侧序列中的非AUG密码的翻译作用。

茎环结构除了对翻译起始有阻抑作用外，在一定条件155.1.6.重叠基因

重叠基因是原核生物中最常见的现象。它的生物学意义不仅在于可以使较少的遗传物质中包含更多的遗传信息；而且在于可以对基因表达的调控起重要作用，其中包括对翻译的调控。简单的例子，如在大肠杆菌噬菌体λ、φX174、G4和丝状RNA噬菌体等中，主要表现为通过不同的读码方式（即选用不同的起始密码和终止密码），可以从同一段核苷酸顺序翻译出不同的蛋白质。复杂些的例子，如在大肠杆菌染色体上的色氨酸操纵子和半乳糖操纵子中，表现为通过翻译偶联来调控翻译起始。

(盛先生书p365-369的内容就是介绍这种调控机制的两种不同形式)5.1.6.重叠基因161).通过重叠的密码保证同一个核糖体对两个连续的基因转录物进行有效的翻译

大肠杆菌色氨酸操纵子由五个基因组成。它的转录本为多顺反子复合转录单位：

TrpEDCBA---------→转录方向

---------→翻译方向其中基因E的终止密码与基因D的起始密码之间有一个核苷酸的重叠：

TrpE

-thr-phe-stopACU-UUC-UGAUGGCU------

TrpDstart-ala------

在野生型菌株中，当核糖体对TrpE翻译终止时，立即就可以转入对TrpD的翻译起始。但在TrpE发生无义突变时，核糖体在未达到终点前就解离，从mRNA上脱落，而TrpD又没有自己的AUG理想旁侧序列，所以它的翻译起始大受影响。而这个操纵子的下游基因TrpC，B之间由于相隔了11个碱基，所以不存在这种翻译偶联。1).通过重叠的密码保证同一个核糖体对两个连续的基因转录物17

但是这种情况并不是绝对的。例如：TrpB和TrpA这两个基因的产物也要以等摩尔结合成四聚体的色氨酸合成酶。它们的基因也是首尾重叠的(见盛先生书p367),但并没发现有翻译偶联的现象。因此，可能还有其他的翻译调控机制。2).通过前一个基因终止密码前存在的核糖体结合序列,使后一个邻近的基因进行有效的翻译例如：大肠杆菌半乳糖操纵子galE.T.K.中的T与K的翻译情况就是这样。（见盛先生书p367）

galT基因终止密码前的GGAG顺序就是原核生物SD序列中的核心顺序，是核糖体结合mRNA的识别信号。

但是这种情况并不是绝对的。例如：TrpB和TrpA185.1.7.RNA的高级结构

f2是RNA噬菌体，它的所有基因都在自己这个RNA分子上。整个分子通过分子内的氢键形成了复杂的空间结构。这种空间结构恰巧使得复制酶的翻译起始部位被编码外壳蛋白的RNA部分的高级结构所掩盖。只有当外壳蛋白翻译出氨基端后，RNA的高级结构被打开，才能使复制酶开始翻译。

(见盛先生书p371的表8－3)基因表达的翻译调控课件195.2.3'-UTR结构对翻译的调控作用真核生物mRNA3’UTR包括终止密码及其旁侧序列、UA序列和poly(A)尾等结构元件。它们参与翻译过程并起调节作用。5.2.1.翻译终止密码及其旁侧序列1).

终止密码研究表明，三个终止密码在不同生物的mRNA中使用频率是不一样的。

UGA在脊椎动物、单子叶植物中使用频率最高；

UAA在其他真核生物中；

UAG使用频率最低。2).

终止密码的旁侧序列经分析多种基因的终止密码旁侧序列后发现，mRNA终止密码下游第一个核苷酸的分布有明显的倾向性，表现为“四核苷酸终止序列”的现象。例如：

真核生物中

A,G核苷酸出现频率在60－70％间。

在

C………………小于17％

原核生物中

U………………最高5.2.3'-UTR结构对翻译的调控作用20

在酵母中统计了784个基因终止密码旁侧序列后发现，主要有三种组合：

组合占基因总数％占高表达基因％平均通读率％

A第一组UAAG48860.7UA

UAGU第二组A38100.69

UGAGU

UAAC第三组C1343.3

UAGG

UGAC在酵母中统计了784个基因终止密码旁侧序列后发现，主21

由上表可见，第一组的使用频率最高，终止效率也最高。因此高表达基因多采用这种组合。相比较而言，在所有终止密码旁侧序列中，第4位核苷酸为C时的终止效率最低。表明这个位置的核苷酸可能与终止作用的调节有关。此外，终止密码前、后的密码子种类对终止效率也有很大影响。许多真核生物mRNA终止密码上游的第一个密码子往往是AAG。所以，赖氨酸是真核mRNA翻译产物羧基端最常见的氨基酸。提示这样的结构可能有利于翻译终止的效率。实验发现，如果在终止密码之前或之后插入一个密码子CAA（gln），就会增加终止密码的通读效率。如果在终止密码前、后同时插入CAA，则会大幅度增加通读效率。表明这样的结构对于翻译终止是不利的。由上表可见，第一组的使用频率最高，终止效率225.2.2.UA序列对翻译的调控作用

在许多编码细胞因子的mRNA3’UTR中都有富含UA的保守序列。它通常由几个相间分布的UUAUUUAU八核苷酸组成。若除去这段序列可以明显提高mRNA的稳定性。因此，UA序列是对翻译起抑制作用的顺式元件。它的抑制效率与它在3’UTR中的拷贝数正相关。5.2.2.UA序列对翻译的调控作用235.2.3.Poly(A)尾的翻译调控作用

在真核生物中，除组蛋白mRNA等少数几种mRNA外，绝大多数前体mRNA在核内被转录出来后，其3’

端加尾识别信号序列AAUAAA下游约30碱基范围内的特定位点被切割和修剪，随后由末端腺苷酸转移酶催化加上poly(A)尾。Poly(A)尾的长度范围:

哺乳动物细胞内约为200－250碱基低等真核……………100碱基

mRNA从核内转运到胞质后，poly(A)尾被进一步缩短。不同种类的mRNA，各自poly(A)尾的长度明显不均一。此外，Poly(A)尾不是裸露的，而是结合着poly(A)结合蛋白(Poly(A)BindingProtein,PABP)。

poly(A)尾的功能不仅与mRNA由核向胞质的转运有关，而且对mRNA稳定性及翻译效率都有调控作用。5.2.3.Poly(A)尾的翻译调控作用241).Poly(A)尾与mRNA的稳定性

蛋白质在细胞中的丰度主要取决于编码该蛋白的mRNA在细胞中的丰度，而mRNA的丰度是取决于其合成与降解的速度。一般用半衰期T1/2这个指标来衡量mRNA在细胞内的稳定程度。通常，那些需要快速适应环境变化的生物，它们的mRNA半衰期普遍较短；反之，就较长。因此，从总体来看，随着生物进化程度由低等到高等，它们的mRNA半衰期也有逐渐增加的趋势。例如下表所示：生物mRNA半衰期(分钟)

E.coli2Yeast10–20Mammal数小时

1).Poly(A)尾与mRNA的稳定性25

即使在同一生物体内，不同mRNA的半衰期也不一样。对生命周期有重要影响、需要快速调节的分子，其mRNA的半衰期就短；看家基因的转录产物不需要快速调节，其mRNA的半衰期就相对较长。例如在酵母中，有一种嘧啶合成途径的转录调节因子PPR1(transcriptionfactorregulatingpyrimidinepathway)，它的mRNAT1/2仅为1分钟。另一种在糖代谢途径中起重要作用的组成型表达酶——

磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase,PGK)的mRNAT1/2可长达35分钟。即使在同一生物体内，不同mRNA的半衰期也不一样。26

研究发现，poly(A)尾对mRNA分子的稳定作用需要PABP的存在。有些短效的mRNA能快速更新的主要原因就是其mRNA3’UTR中存在多个UA序列。当结合在mRNA末端的PABP迁移到UA序列区域时，就会导致PABP与poly(A)尾的分离，使poly(A)尾裸露，从而导致poly(A)尾的降解发生。poly(A)尾长度逐渐变短，直到最终消失是mRNA开始降解的先兆。一旦poly(A)尾被除去，mRNA就会在内切和外切核酸酶的作用下沿3’→5’方向迅速降解。

研究发现，poly(A)尾对mRNA分子的稳定作用需27

在真核细胞中，mRNA的降解途径主要有两条。

1).脱腺苷酸依赖途径在poly(A)尾上结合的PABP蛋白与poly(A)尾形成的复合物具有抑制mRNA5‘帽结构降解的功能。当poly(A)尾全部丢失或接近全部丢失(缩短到10-15个核苷酸残基)时，PABP蛋白不能再结合上去，这时mRNA5’帽结构的降解即被启动。

2).脱腺苷酸非依赖途径这是由于mRNA正常翻译区内存在的异常翻译终止密码被激活，导致脱帽降解过程的启动。在真核细胞中，mRNA的降解途径主要有两条。28

在这两条途径中，对降解速率具有决定意义的是mRNA5’

帽结构(m7G)的脱落。这就使mRNA暴露于xrn1基因编码的一种具有极强降解活力的5’→3’外切核酸酶的作用下。此外，参与脱帽降解过程的还有dcp基因编码的脱帽因子(也称脱帽酶)，实际是脱帽复合体中的一个必要组份。许多动物在卵细胞成熟和早期胚胎发育过程中,母体mRNA用脱尾或加尾的办法调节翻译：不需要的mRNA经脱尾后降解；暂时不用的mRNA脱尾后并不降解，以后需要翻译时再重新加尾，然后翻译。这种调节作用的加尾过程是在胞质内进行，与核内前体mRNA的加尾过程是不同的。AAUAAA及其上游UTR内的寡聚U是胞质中添加poly(A)尾的信号结构。在这两条途径中，对降解速率具有决定意义的是292).Poly(A)尾与翻译效率

体内和体外试验都已证明，mRNA的poly(A)尾结构与翻译效率直接有关。这表现在：有尾的mRNA翻译效率比脱尾的mRNA高得多。一般可高出10－30倍。例如，体外翻译系统中：——————————————————————————————————————翻译效率m7G－mRNApoly(A)－

m7G＋mRNApoly(A)－

m7G＋mRNApoly(A)＋

______________________________________________________________基础低低高______________________________________________________________加入外源poly(A)0激活抑制______________________________________________________________再加入PABP00解除抑制——————————————————————————————————2).Poly(A)尾与翻译效率30试验结果显示：

(1).有poly(A)尾的mRNA翻译效率明显高于无尾的。

(2).加入外源性poly(A)，对含帽结构的无尾mRNA有翻译激活作用；而对既无尾又无帽的mRNA无激活作用。这表明poly(A)尾对翻译的激活作用依赖于mRNA5’帽结构的存在。

(3).加入外源性poly(A)，明显抑制有尾mRNA的翻译效率。

(4).但这种抑制作用可因加入外源性PABP而消除。这表明，poly(A)尾促进翻译的作用需要PABP的存在，而外源性poly(A)对有尾mRNA产生的抑制作用是由于竞争PABP造成的。

上述结果表明：3’UTR和poly(A)尾对翻译的调控作用主要表现在对翻译起始效率的影响，同时也包括对mRNA稳定性的影响试验结果显示：315.3反式因子对翻译的调控

翻译的调控机制不仅与mRNA结构有关，而且与多种参与翻译过程的反式因子有关。5.3.1.核糖体蛋白的合成对翻译的调控作用

核糖体由rRNA和核糖体蛋白构成，是翻译mRNA上遗传密码的唯一场所。实验证明，核糖体蛋白不仅能与rRNA专一性地结合，也与编码其自身的mRNA上翻译起始区结合。而核糖体蛋白mRNA的合成是受其自身蛋白产物的翻译阻遏调控的。

mRNA

核糖体蛋白

核糖体

rRNA5.3反式因子对翻译的调控32

细胞合成蛋白质的能力是由核糖体数目的多少决定的。营养条件好时，氨基酸丰富，核糖体就多；反之就少。在细菌中，对环境中氨基酸丰度变化最先作出反应的是rRNA和tRNA。这两种RNA基因的启动子与mRNA不同。在它们启动子的－10区下游有一个鉴别子元件，能对环境中的ppGpp作出反应。

当氨基酸缺乏时，大肠杆菌relA基因编码的酶催化GDP转变为ppGpp,ppGpp可直接与RNA聚合酶作用，然后识别鉴别子并停止这两种RNA的转录，使rRNA的数量急剧下降。

核糖体蛋白本应与rRNA结合并组装成核糖体参与翻译。由于rRNA的量剧减,核糖体蛋白失去足够的结合对象而成为多余。这些多余的核糖体蛋白就会与编码其本身的mRNA结合，从而阻断这种mRNA的翻译。结果使核糖体蛋白的翻译与rRNA的转录几乎同时停止。

335.3.2.Qβ噬菌体中的翻译阻遏机制

Qβ噬菌体是一种线状单链RNA噬菌体，它的基因组包含三个基因。从5‘→3’方向依次编码成熟蛋白、外壳蛋白和RNA复制酶。当噬菌体RNA进入被感染的细菌，其(+)链的亲本RNA立即作为mRNA翻译出RNA复制酶。RNA复制酶随即以(+)链的亲本RNA为模板，合成(-)链RNA。然后，RNA复制酶又以(-)链RNA为模板合成(+)链RNA。(+)链RNA被包装在外壳蛋白中便成为成熟的Qβ噬菌体。在这个过程中存在一个矛盾的现象，即：在以(+)链的亲本RNA作为mRNA翻译时，(+)链的亲本RNA上已被不少核糖体占据。它们从5‘

向3’

方向进行翻译。这样,就会阻碍RNA复制酶以(+)链RNA为模板由3‘往5’

方向合成(-)链RNA。5.3.2.Qβ噬菌体中的翻译阻遏机制34基因表达的翻译调控课件35

矛盾的解决在于Qβ噬菌体RNA复制酶的特性。它既能与(+)链RNA的3’端结合，以便起始(-)链RNA的复制；又能与(+)链RNA上编码外壳蛋白基因的翻译起始区结合，从而抑制外壳蛋白的翻译起始。经过对这两个结合区分析后发现，它们具有核苷酸序列上的同源性和二级结构上的相似性。因此，除了已经起始的外壳蛋白翻译仍能继续进行底外，其它核糖体便不能再与外壳蛋白的翻译起始区结合。于是已经与(+)链RNA的3’端结合的RNA复制酶就可以顺利地复制到底。在这个例子中，Qβ噬菌体RNA复制酶是作为一种翻译阻遏物发挥调节功能的。

矛盾的解决在于Qβ噬菌体RNA复制酶的特性。它365.3.3.代谢产物对翻译的调控作用

在原核生物中，基因表达的调控主要在转录水平上进行。在真核生物中，由于mRNA比较稳定，所以除了在转录水平上的调控外，还可以在翻译水平上进行调控。其中，代谢产物对翻译的调控作用是一个很重要的方面。珠蛋白的合成受血红素调控就是个典型的例子。血红蛋白是由珠蛋白和血红素组成的。因此，血红蛋白的合成需耗用这两种蛋白。然而，珠蛋白的合成又受到血红素的控制。只有血红素充足时，珠蛋白才能合成，进而使得血红蛋白也能高效合成。研究发现，血红素对珠蛋白合成的控制发生在珠蛋白翻译的起始阶段，主要是通过一种名为血红素控制的翻译起始抑制物

(hemin-controlledtranslationalinhibitor,HCI)使翻译起始因子eIF-2磷酸化而抑制翻译的起始。所以，HCI的本质就是eIF-2激酶，它能催化eIF-2的磷酸化。5.3.3.代谢产物对翻译的调控作用37eIF-2能以两种状态存在：未磷酸化的eIF-2具有起始活性,能参与蛋白合成的。被磷酸化的eIF-2则没有起始活性，不能参与蛋白合成。催化eIF-2磷酸化的HCI是eIF-2激酶，因此，HCI是一种翻译抑制物。

但是，HCI也以两种状态存在：未磷酸化的HCI没有活性，磷酸化的HCI才有活性。催化HCI磷酸化的是一种依赖于cAMP的蛋白激酶。所以，这种依赖于cAMP的蛋白激酶对于翻译起始来说就是一种负调控因子。

依赖于cAMP的蛋白激酶有两个调节亚基(R2)和两个催化亚基(C2)组成。只有当它的调节亚基与cAMP结合时，它的催化亚基才被释放而表现活力。

当有血红素存在时，血红素就与这个蛋白激酶结合。这时即使有cAMP存在，它也不能释放催化亚基。上述三个反应都被抑制。这时eIF-2就能以活性形式参与蛋白合成。

所以，在整个调控网络中，血红素对于珠蛋白的翻译起始来说是起到了一种正调控因子的作用。

eIF-2能以两种状态存在：未磷酸化的eIF-2具有起38基因表达的翻译调控课件395.3.4.反义RNA

反义RNA是指与靶RNA具有互补序列的小分子RNA(一般为200个碱基左右)，它通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与基因表达的调控。转录产生反义RNA的基因就是反义基因。5.3.4.1.原核生物中反义RNA对翻译的调控作用反义RNA对原核生命现象起着重要的调节作用。例如在渗透压调节，质粒复制，Tn转座，染色质基因的表达，接合与不相容性的调节，以及噬菌体溶源和溶菌状态的转换等过程中。原核生物中反义RNA对基因表达的调节可以发生在复制、转录和翻译这三个水平上。例如，它可与引物前体RNA互补，从而抑制DNA复制合成；也可与正在转录中的mRNA5’端互补，形成特殊结构而使转录停止。根据反义RNA抑制翻译过程的作用方式，可以把它们分为两类：I类分子能与靶mRNA的SD序列和包括起始密码AUG在内的部分编码区结合，直接抑制翻译的起始。II类分子通常能与mRNA的非编码区互补配对,使mRNA构象改变并影响其与核糖体的结合，起到间接抑制翻译的作。5.3.4.反义RNA405.3.4.2.真核细胞中的反义调节现象在真核细胞中天然反义调节的现象也很常见。主要有四种类型：1).

分子内碱基配对：例如，c-mycmRNA分子内部会形成茎环结构，使第一个AUG位于环的突出部位而影响mRNA翻译的起始。2).

分子间碱基配对：例如，U1RNA的5’端与前体mRNA中内含子5’端剪接位点部分互补，促进加工过程的发生。3).

作用于mRNA5’端，影响加帽反应，阻止mRNA成熟。4).

作用于mRNA3’端poly(A)尾，抑制正常翻译过程。例如，在鸡胚匀浆中存在一类富含U的寡核苷酸称为tcRNA(translationcontrolRNA)。它们可以与肌球蛋白重链mRNA的poly(A)加尾信号结合，影响正常的翻译过程。5.3.4.2.真核细胞中的反义调节现象415.3.4.3.反义RNA研究的意义及应用

为了研究基因的功能，人们常借助于基因突变的方法。但有时制造和筛选突变并不是一件容易的事，尤其是要在真核生物中筛选某一突变型远比在原核生物中困难的多。应用反义RNA对翻译抑制的原理为我们研究生物中某一基因的表达是否必要提供了一条有效的途径。把针对某一特定基因功能的反义RNA引入细胞，通过抑制靶基因mRNA的翻译而制造突变表型。这样就可以使对基因功能的研究更精确、更特异。然而，这样得到的突变体并不是真正意义上的基因突变，因为它并不涉及到靶基因DNA结构的改变，而只是靶基因表达的表型受到了抑制。所以，这类突变称为模拟突变或模拟表型。5.3.4.3.反义RNA研究的意义及应用42

根据反义RNA抑制靶基因表达的原理，已经发展出了一种反义技术。通过设计能特异封闭某些靶基因表达的多种反义RNA分子，用于有针对性地控制这些基因的表达。这不仅可以作为一种有效的科学研究方法，有助于阐明基因表达和调控方式的多样性；而且也可用于在实际中有目的地控制特定基因的表达，使它成为基因治疗的方法之一。例如在抗肿瘤方面，有人使用与HL-60细胞c-myc基因互补的15核苷酸的人工反义RNA成功地抑制了c-myc蛋白产生，使恶性细胞生长减缓。在抗病毒感染方面，已证明用反义RNA能有效地抑制疱疹病毒、流感病毒和HIV病毒对培养细胞的侵袭。

根据反义RNA抑制靶基因表达的原理，已经发展出435.3.5.RNA干扰

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，由双链RNA（DoubleStrandRNA,dsRNA）指导，在特定酶参与下，降解外源或内源mRNA，导致基因表达沉默（即不表达）。这种现象发生在转录或转录后水平，故又称转录或转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS/TGS)。5.3.5.RNA干扰445.3.5.1.RNA干扰的发现

1995年,美国康乃尔大学的SuGuo博士等人在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断该基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地阻断了par-1基因的表达途径。

这种现象与传统意义上对反义RNA技术的解释正好相反。对此结果她们一直未能给出合理的解释。5.3.5.1.RNA干扰的发现

45

1998年,美国华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们认为以往反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。Fire等人把这一现象称为RNA干扰。此后又相继发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴,一直到人类的几乎所有真核生物细胞。1998年,美国华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学46安德鲁·菲尔（AndrewFire），生于1959年，1983年麻省理工获生物学ph.D，斯坦福医学院病理学和遗传学教授

克雷格·梅洛（CraigMello），出生于1960年，1990年哈佛获生物学ph.D，马萨诸塞州医学院分子医学教授安德鲁·菲尔（AndrewFire），生于1959年，147基本概念dsRNA：双链RNA，包含有义链和反义链Dicer：RNaseⅢ家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶siRNA：小干扰RNA(smallinterferingRNA)，RNAi的关键效应分子，21~23bp大小的双链RNARISC：RNA诱导沉默复合体(RNA-inducingsilencingcomplex)，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性，碱基互补配对识别靶mRNA使其降解.RdRP：RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerases),RNAi调节因子，RdRp能够增强RNAi信号，逐级放大dsRNA诱导的基因沉默。基本概念dsRNA：双链RNA，包含有义链和反义链485.3.5.2.RNA干扰的作用机制

当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA。

siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。5.3.5.2.RNA干扰的作用机制

49

RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合,并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用逐级放大，最终将靶mRNA完全降解。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性50基因表达的翻译调控课件51RNAi引发的基因沉默机制RNAi引发的基因沉默机制52siRNA的反义链与目的mRNA结合后不仅诱导RISC对该基因进行降解，而且还激活RdRp介导的ssRNA的合成，产生大量的dsRNA。新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量次级siRNA，进入下一个RNAi循环，使RNAi的作用逐级放大。因此只要有很少量的dsRNA，就能在整个生物体中的目标基因发生基因沉默。RNAi的扩增与扩散效应siRNA的反义链与目的mRNA结合后不仅诱导RNAi的扩增53

RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要指出的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起相应基因的非正常沉默。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。54RNAi干扰现象的重要特征：1).RNAi是转录后水平的基因沉默机制；2).RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；3).RNAi抑制基因表达是以催化放大的方式进行的，而且具有很高的效率。因此很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，可以达到缺失突变体表型的程度；4).RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体，以及可遗传等特点;5).dsRNA不得短于21个碱基。长链dsRNA在细胞内会被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰；6).RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能由于Diecer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。RNAi干扰现象的重要特征：555.3.5.3.RNAi技术的应用

RNA干扰现象在生物中存在的普遍性及RNAi作用机制和生物学功能的初步阐明，为RNAi技术的应用提供了理论基础。

RNAi技术目前已经在功能基因组学、微生物学、基因治疗和信号转导等广泛的研究领域里取得了令人瞩目的进展，使其在医学领域包括动物医学领域在内的应用有着广阔的前景。

5.3.5.3.RNAi技术的应用

561).研究基因功能

由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。

2).病毒性疾病的治疗

siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多病毒性传染病的防治具有十分重大的意义。1).研究基因功能57

3).肿瘤病的治疗

肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果。传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长。RNAi技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时沉默的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时沉默。

3).肿瘤病的治疗

58

mRNA降解是转录后调控的一种方式

在真核细胞中，前体mRNA的加工与运输过程通常是同时进行的。成熟mRNA一旦进入胞浆，就有可能被降解。mRNA的运输和定位也是转录后调控的一种方式在胞浆内,mRNA翻译的分布是不均匀的,蛋白质的分布也是不均匀的。这不是因为蛋白质单纯扩散造成的，而是由于mRNA的运输和定位决定的。一般把对mRNA成熟、降解和胞浆内定位等翻译起始前过程的调控统称为转录后调控。

mRNA降解是转录后调控的一种方式59各种生物的蛋白质翻译体系大致相同：

mRNAtRNAcis-

核糖体蛋白质翻译体系酶系trans-

细胞因子其他小分子

翻译的过程主要包括三个阶段：翻译的起始、延伸和终止。各种生物的蛋白质翻译体系大致相同：60蛋白质翻译后的多种加工方式：修饰(modification)

折叠(folding)

分拣(sorting)

运输(traffiking)

定位(targeting)翻译水平上的调控机制大致可分为两种类型：

1.不受环境因素影响的。这种机制包含在基因的顺式结构中；

2.随环境因素变化而调节的。这种机制是反式作用的。翻译调控主要表现为翻译起始的调节。翻译调控的关键在于mRNA的结构。蛋白质翻译后的多种加工方式：615.1.翻译起始的调控

一个成熟的mRNA分子，其结构不仅包括氨基酸顺序的编码序列，而且也包括其5’和3’两端的非编码区(untranslatedregion,UTR)。因此，蛋白质的翻译不仅与mRNA的编码序列有关，而且受5’和3’UTR结构的控制。5.1.翻译起始的调控625.1.1.原核生物mRNA模板的核糖体结合序列

核糖体结合序列(RibosomeBindingSequence,RBS)是指起始密码AUG上游30－40碱基的一段UTR。RBS中有SD序列(Shine-Dalgarno,SD)。经计算机分析了74种原核生物的mRNA，认为SD序列为：5’-AAGGAGGU-3’八聚体，它和16SrRNA3’端的3’-AUCCUCCA-5’配对。其中GGAG是其核心。5.1.1.原核生物mRNA模板的核糖体结合序列635.1.2.真核生物mRNA的5’帽结构

所有真核生物mRNA5’端都有以5’-5’磷酸二酯键相连的帽结构m7GpppN。

1976年Shatkin就由体外试验结果发现，帽结构具有以下四个方面的作用：

1).

保护mRNA不被5’外切酶降解,增加mRNA稳定性；

2).

有利于mRNA从胞核向胞质的转运；

3).

有增强翻译的作用；大量体内和体外试验都证实，大多数mRNA的翻译活性依赖于帽结构。虽然未被甲基化的帽结构也能保护转录物不被5’外切酶核酸酶降解，但只有当它被甲基化后，才能被有效地翻译。

4).5’帽结构与3’poly(A)尾对mRNA翻译效率的调节有协同作用。

5.1.2.真核生物mRNA的5’帽结构64例外的情况：

属于小RNA病毒科(picornavirus)的(+)链RNA却没有5‘帽结构。例如：脊髓灰质炎病毒、脑-心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒和柯萨奇病毒(coxsackievirus)等。这些病毒侵入细胞后首先终止了宿主细胞的翻译，然后利用宿主细胞质中的核糖体进行以病毒RNA为模板的蛋白质合成。核糖体通过直接与病毒RNA5’UTR结构中的内部核糖体进入位点(InternalRibosome-entrySite,IRES)相结合，进行蛋白质的翻译。例外的情况：655.1.3.翻译起始密码的位置及其旁侧序列1).

AUG的位置根据资料分析表明，90－95％的真核mRNA的翻译启动开始于最靠近其5’端的第一个AUG密码。这就是第一AUG规律。如果在正常起始密码子上游再引入一个带最适旁侧序列的AUG密码时，会出现两种情况：如果新的阅读框架与原阅读框架不一致，结果会强烈抑制原有AUG的启动，而表现为新插入AUG的翻译作用；如果新插入的AUG与原有阅读框架保持一致，则新的AUG代替原来的起始密码，翻译产物包含原表达蛋白。5.1.3.翻译起始密码的位置及其旁侧序列66例外的情况：在高等真核细胞中，一些原癌基因和生长调节因子基因产生的mRNA5’UTR内往往有一个以上的AUG，其翻译起始作用并不遵循第一AUG规律。表明这些基因的表达存在翻译水平的调节。当某些mRNA5’UTR区中存在一个以上AUG密码时,其中只有一个AUG是主要读框的翻译起始位点。存在于它上游的其他AUG被称为“上游AUG”。这些上游AUG的存在往往抑制其下游读框的翻译效率。例如，酵母细胞中有正调控作用的转录调控因子GCN4，其mRNA5’UTR中含有四个ORF，这些ORFs对主要ORF的翻译有抑制作用。(童克中《基因表达》p268)

例外的情况：672).

AUG的旁侧序列

在翻译起始的调节中，除了AUG的位置具有重要性外，AUG的旁侧序列与翻译起始效率也有密切关系。在原核生物中，有人通过对大肠杆菌lacZ基因进行突变研究，结果证明AUG上游第一个三联体以UAU、CUU为最佳。而UUC、UUA或AGG则降低翻译效率20倍。此外,AGG易与SD序列混淆，应予避免。在真核生物中，M.Kozak于1987年通过对699种脊椎动物mRNA翻译起始密码AUG5‘和3’两侧核苷酸序列的分析，发现了一个共有序列(consensusesequence),也即理想的旁侧序列。2).AUG的旁侧序列68

Kozak对AUG起始密码两侧的核苷酸进行过系统的突变试验，发现－3位的A和＋4位的G对于AUG被起始识别具有显著的促进作用。如果－3位不是A，则＋4位的G对于有效的翻译起始是必须的。

1991年Cavener等对真核mRNA起始位点旁侧序列做了广泛的统计学分析，进一步证实了－3位的A是真核生物mRNA的普遍规律。并且发现-3,-2和-1位具有较强的三核苷酸倾向：脊椎动物最常见：ACC和GCC;

非脊椎动物最常见：AAA和ACA;

脊椎动物病毒：AAA。Kozak对AUG起始密码两侧的核苷酸进行过系统69真核基因mRNA起始密码旁侧的共有序列

共有序列物种-3-2-1+1+2+3+4脊椎动物GCCGCCACCAUGGG植物AAAAAUGGC果蝇UAAAAUG

A

C

酵母AAAAAAAUGUCU

UCC原生动物AAAAAAAAAAAAAUGA

UUUUUUUUU真核基因mRNA起始密码旁侧的共有序列705.1.4.翻译起始先导序列的长度(Leaderlength)

Kozak通过系统地构建和分析了一系列不同5‘UTR长度的转录体后发现,当5’UTR中第一个AUG离5’帽结构的位置太近时，不会被核糖体40S亚基识别。例如：当第一个AUG与5’帽结构间距在12个碱基以内时，尽管把起始密码置于理想的旁侧序列中，仍有一半以上的40S亚基会滑过第一个AUG，从其下游AUG起始翻译。当把间距增加到20个碱基长度时，可以防止核糖体滑过的现象。当间距在17－80个碱基之间时，体外翻译效率与其长度成正比。由此可见，先导序列的长度影响翻译起始的效率和翻译起始的准确性。

5.1.4.翻译起始先导序列的长度(Leaderle715.1.5.5‘-UTR高级结构的影响

当5’UTR中存在碱基配对区时，就可以形成茎环结构。这类结构会妨碍核糖体对mRNA起译部位的结合，阻止核糖体40S亚基的迁移，对翻译起始具有顺式阻抑作用。其阻抑作用的强弱取决于茎环结构的稳定性和其在5’UTR中的位置。

1).茎环结构的稳定性碱基配对区越长或GC对含量越高，发卡结构越稳定。

2).茎环结构在5’UTR中的位置

Kozak将有一定稳定性的茎环结构置于距5’

帽结构仅12碱基的位置上，结果核糖体40S亚基不能与mRNA结合，影响了翻译的起始。当他把这一结构置于距5’

帽结构52碱基位置时，就不影响核糖体对mRNA的结合与翻译的起始。这表明，虽然mRNA5’近端的二级结构能阻碍核糖体40S亚基及起始因子复合物与翻译模板的结合。但是，一旦形成这种结合后，起始复合物就有能力穿透二级结构区。这种穿透作用可能与某些起始因子具有解旋酶活力有关。5.1.5.5‘-UTR高级结构的影响72

茎环结构除了对翻译起始有阻抑作用外，在一定条件下，也能以正调节方式促进翻译起始过程。这种促进作用表现在两方面：

1).当一个处于非理想旁侧序列中的AUG，其下游适宜的邻近位置有茎环结构时，翻译作用可以从这个AUG开始。例如：通过试验把茎环结构分别置于非理想旁侧序列中的AUG密码下游不同距离处，观察这个AUG起始翻译的效率。结果发现，当茎环结构位于该AUG下游14个碱基的距离时，增强了它的翻译起始效率；而位于2个碱基或32个碱基时则没表现出这种促进作用。

2).下游茎环结构能激活处于理想旁侧序列中的非AUG起始密码的作用。现已发现某些天然mRNA的翻译作用起始于非AUG密码,例如：tK酪氨酸激酶的CUG;

小鼠int.2基因转录产物的CUG;

鼠p88Krox-24蛋白的ACG等等。原因就是这些mRNA5’UTR的GC丰富区形成茎环结构来促进其上游处于非理想旁侧序列中的非AUG密码的翻译作用。

茎环结构除了对翻译起始有阻抑作用外，在一定条件735.1.6.重叠基因

重叠基因是原核生物中最常见的现象。它的生物学意义不仅在于可以使较少的遗传物质中包含更多的遗传信息；而且在于可以对基因表达的调控起重要作用，其中包括对翻译的调控。简单的例子，如在大肠杆菌噬菌体λ、φX174、G4和丝状RNA噬菌体等中，主要表现为通过不同的读码方式（即选用不同的起始密码和终止密码），可以从同一段核苷酸顺序翻译出不同的蛋白质。复杂些的例子，如在大肠杆菌染色体上的色氨酸操纵子和半乳糖操纵子中，表现为通过翻译偶联来调控翻译起始。

(盛先生书p365-369的内容就是介绍这种调控机制的两种不同形式)5.1.6.重叠基因741).通过重叠的密码保证同一个核糖体对两个连续的基因转录物进行有效的翻译

大肠杆菌色氨酸操纵子由五个基因组成。它的转录本为多顺反子复合转录单位：

TrpEDCBA---------→转录方向

---------→翻译方向其中基因E的终止密码与基因D的起始密码之间有一个核苷酸的重叠：

TrpE

-thr-phe-stopACU-UUC-UGAUGGCU------

TrpDstart-ala------

在野生型菌株中，当核糖体对TrpE翻译终止时，立即就可以转入对TrpD的翻译起始。但在TrpE发生无义突变时，核糖体在未达到终点前就解离，从mRNA上脱落，而TrpD又没有自己的AUG理想旁侧序列，所以它的翻译起始大受影响。而这个操纵子的下游基因TrpC，B之间由于相隔了11个碱基，所以不存在这种翻译偶联。1).通过重叠的密码保证同一个核糖体对两个连续的基因转录物75

但是这种情况并不是绝对的。例如：TrpB和TrpA这两个基因的产物也要以等摩尔结合成四聚体的色氨酸合成酶。它们的基因也是首尾重叠的(见盛先生书p367),但并没发现有翻译偶联的现象。因此，可能还有其他的翻译调控机制。2).通过前一个基因终止密码前存在的核糖体结合序列,使后一个邻近的基因进行有效的翻译例如：大肠杆菌半乳糖操纵子galE.T.K.中的T与