临床生物化学实验技术

常用生物化学检验技术第五章1第一节光谱分析技术第二节电化学分析第三节电泳技术第四节层析技术第五节离心技术第六节自动生化分析技术

只讲第一节，其它内容在《临床检验仪器学》中讲授。

本章内容概要2教学目标和要求1、掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。2、熟悉分光光度计的的基本结构和操作方法光源检查和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的因素3、了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中的应用。3第一节光谱分析技术分光光度技术的基本原理分光光度计的基本结构分光光度计的操作方法分光光度技术的定性和定量方法4光谱分析技术原理：利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法

吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法

散射光谱分析技术：比浊法

5一、分光光度技术的基本原理（一）吸光度与透光度

A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：T=I/I0T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：6（二）Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：A=KLC式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）7据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。8（三）偏离Lambert-Beer定律的因素应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学和化学两方面的因素。1．光学因素：

要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。

2．化学因素：

浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。

9二、分光光度计的基本结构最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计

光源单色器比色杯检测器显示器五大部份结构：10（一一））光光源源光源源定定义义：：指一种种可以以发射射出供供溶液液或吸吸收物物质选选择性性吸收收的光光。光光源应应在一一定光光谱区区域内内发射射出连连续光光谱，，并有有足够够的强强度和和良好好的稳稳定性性，在在整个个光谱谱区域域内光光的强强度不不应随随波长长有明明显的的变化化。光源种种类：：可见光光分光光光度度计常常用光光源是是钨灯或或卤钨钨灯。。紫外光光光度度计常常用氢灯作为光光源。。11（二））单色色器定义：：将来自自光源源的复复合光光分散散为单单色光光的装装置称称为分分光系统统或单单色器器。种类：：滤光片片棱镜光栅12（三））比色色杯又称为为吸收收池或或比色色皿材料：：常用无无色透透明、、耐腐腐蚀和和耐酸酸碱的的玻璃璃或石石英材材料做做成（五））显示示器（四））检测测器检测器器是将将透过过溶液液的光光信号号转换换为电电信号号，并并将电电信号号放大的的装置置。常常用的的检测测器为为光电电管和和光电电倍增增管。。是将光光电管管或光光电倍倍增管管放大大的电电流通通过仪仪表显显示出出来的的装置。。13三、分分光光光度计计的操操作方方法（一））分光光光度度计的的基本本操作作以721-A型型分光光光度度计为为例，，其基基本的的操作作步骤骤为：：1.开开721-A分分光光光度计计的开开关，，将比比色池池的盖盖子打打开，，通电电20分钟钟使仪仪器预预热。。2.将将波长长旋至至测定定的波波长。。3.将将空白白液、、校准准液或或待测测液放放入比比色池池，将将空白白液置置于光光路中中。4.将将开关关置于于T位位，打打开比比色池池盖子子，用用光量量粗调调和光光量细细调调调节T为0.0,关关上比色色池池盖盖子子，，调调节节T为为100.0。。5.将将开开关关置置于于A，，用用消消光光调调零零调调节节A为为0.06.重重复复步步骤骤4和和57.将将校校准准液液或或待待测测液液推推入入光光路路，，测测量量溶溶液液的的吸吸光光度度（（A））14（二二））吸吸光光度度的的校校正正铬酸酸钾钾的的标标准准液液可可用用于于校校正正分分光光光光度度计计的的吸吸光光度度。。在在25℃℃，，将将4mg铬铬酸酸钾钾溶溶于于100ml的的0.05mol/LKOH中中，，放放入入比比色色池池中中，，在在不不同同波波长长下下测测定定吸吸光光度度值值，，与与己己知知的的标标准准吸吸光光度度校校正正表表进进行行比比较较，，可可检检测测仪仪器器吸吸光光度度的的准准确确度度。15四、、分分光光光光度度技技术术的的定定性性和和定定量量方方法法（一一））分分光光光光度度技技术术的的定定性性方方法法定性性依依据据：：最大大吸吸收收波波长长λλmax和和摩摩尔尔吸吸光光系系数数εε2.摩摩尔尔消消光光系系数数εε方方法法1.最最大大吸吸收收波波长长λλmax方方法法16（二二））分分光光光光度度技技术术的的定定量量方方法法1.标标准曲曲线法法根据Lambert-Beer定定律，，液体体的浓浓度在在一定定范围围内与与吸光光度成成正比比关系系。配配制一一系列列浓度度的标标准品品溶液液（浓浓度应应包含含高、、中、、低浓浓度范范围）），按按标本本处理理方法法作相相同处处理，，在特特定波波长下下测定定吸光光度，，以标准准液浓浓度为为横座座标，，以吸吸光度度为纵纵座标标，按最最小二二乘法法的原原理，，将对对应各各点连连成一一条通通过原原点的的直线线，这这条直直线称称为标标准曲曲线。。待测测溶液液测定定吸光光度后后，从从标准准曲线线上可可查出出其相相应的的浓度度。方法：：17制作和和应用用标准准曲线线时应应注意意下面面几点点：（1））测定定条件件发生生变化化时（（如更更换标标准品品和试试剂等等），，应重重新绘制。。（2））标准准品应应有高高的纯纯度，，标准准液的的配制制应准准确。。（3））当待待测液液吸光光度超超过线线性范范围时时，应应将标标本稀稀释后后再测测定。。（4））标本本测定定的条条件应应和标标准曲曲线制制作时时的条条件完完全一一致。。182．比比较法法Cu=(Au×Cs)/As己知浓浓度的的标准准品和和标本本作同同样处处理，，使用用相同同的空空白，，同时测测定标标准管管和标标本的的吸光光度，，根据据测定定的吸吸光度度及标标准品浓度度，可可直接接计算算出标标本的的浓度度，计计算公公式为为：其中Cu和和Au为标标本管管浓度度和吸吸光度度，Cs和和As分别别为标标准管浓度度和吸吸光度度。用用标准准品法法定量量时，，标准准品的的浓度度应尽尽量和标本本管浓浓度相相近。。193．其其它分分析方方法包括差差示法法、多多组份份混合合物分分析和和利用用摩尔尔吸光光系数数分析析等方方法。。20五、其其它光光谱分分析技技术（一））火焰焰光度度法（二））原子子吸收收分光光光度度法（三））荧光光光度度分析析法1．基基本原原理2．组组成1．基基本原原理2．组组成3．原原子吸吸收分分光光光度法法的特