薄层色谱-过柱子

过柱子总结（吸附剂与洗脱剂）一、吸附剂与洗脱剂根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。1．吸附剂的要求对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速（一般为1.5mL・min-1）通过色谱柱。材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。2、 常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。3、 几种常见吸附剂的特性（1） 氧化铝：市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100〜150目。碱性氧化铝（pH9—10）:适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。酸性氧化铝（pH3.5—4.5）:适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。中性氧化铝（pH7—7.5）:适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。（2） 硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2・xH2O,又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。适用范围:非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。（3） 聚酰胺:色谱用聚酰胺主要又锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在16000〜20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。聚酰胺色谱的原理:兼具吸附色谱和分配色谱的功能。采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱——正相色谱；采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱——反相色谱。分离对象:能与聚酰胺形成氢键的化合物，如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。聚酰胺在水中吸附能力的规律:形成氢键的基团（如:酚经基、按基、酪基、硝基等）越多，则吸附力越强。如：丁二酸〉丁酸形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小。芳香核、共轭双键多者吸附力大，少者吸附人小。若形成分了内氢键，则使化合物的吸附力减小。（4）硅酸镁：中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。3．吸附剂的活度及其调节吸附剂的活性取决于它们含水量的多少，活性最强的吸附剂含有最少的水。吸附剂的活性一般分为五级，分别用I、11、III、W和V表示。数字越大，表示活性越小，一般常用II〜III。向吸附剂中添加一定的水，可以降低其活性。反之，如果用加热处理的方法除去吸附剂中的部分水，则可以增加其活性，后者称为吸附剂的活化。各种不同活度吸附剂的含水量见表表3—6各种不同活度的吸附剂的含水量活度 氧化铝（水%） 硅胶（水%） 硅酸镁（水%）I 0 0 0I 3 5 7I61515W102525V1535354、实验操作吸附剂用量的确定-柱子的选择-装柱-柱留体积的测量-加样或拌样-洗脱-分部收集_检测_合并_浓缩氧化铝：一般选择中性，粒度150〜200目,超过220目需加压；一般用量1g样品/20〜50g,特例1g样品/100〜200g硅胶：吸附色谱——1g样品/20〜50g，特例1g样品/500〜1000g,用前最好120烘24h,可不做活性测定。分配色谱——1g样品/100〜1000g，特例1g样品/10000g。色谱柱的选择：有玻璃柱和不锈钢柱两种，一般不使用有机玻璃柱，实验室常用玻璃柱；径长比一般为1:10〜1:20，特例1:40；内壁光滑均匀，上下粗细一样，管壁无裂缝，活塞密封良好；根据吸附剂用量（体积）确定柱子的大小，一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4〜1/5左右装柱：有干装法和湿装法两种。干装法——在下端减压抽气的同时，将吸附剂通过长径漏斗缓缓到入柱内。湿装法——①准确加入一定体积的溶剂，然后缓慢加入吸附剂，必要时可轻敲柱壁，排除多余溶剂，计算主留体积；②准确量取一定体积的溶剂倒入称量好的吸附剂，间歇性搅拌数次,静置过夜，次日在搅拌下装柱，计算主留体积。加样：将样品溶于合适的溶剂，在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。最后在用少量清洁溶剂对主壁洗涤2〜3次；将样品溶于合适的溶剂后，在搅拌下加入样品量3〜5倍的吸附剂，晾干至粉末状，然后在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。洗脱必须注意在洗脱的过程中，尤其是开始阶段，不能扰动层面。洗脱速度一般为每分钟流出1/200柱留体积左右。对于梯度洗脱需注意标记不同溶剂的分界管号。分部收集：一般每管收集1/20〜1/10柱留体积检测：确定目标物的位置及纯化情况薄层色谱或纸色谱检测；气相色谱或液相色谱检测；合并：成分相同或相似的收集液合并，交叉部分单独收集。浓缩：旋转薄膜蒸发；确保烧瓶干燥干净。展开剂的极性规律单一溶剂的极性大小顺序为：石油醚（小）一环己烷一四氯化碳一二氯乙烯一＞苯一甲苯一＞一氯甲烷f氯仿f乙醚f乙酸乙酯f乙酸甲酯f丙酮f正丙醇f甲醇f吡啶f乙酸（大）混合溶剂的极性顺序：苯：氯仿（1+1）f环己烷：乙酸乙酯（8+2）f氯仿：丙酮（95+5）f苯：丙酮（9+1）f苯：乙酸乙酯（8+2）f氯仿：乙醚（9+1）f苯：甲醇（95+5）f苯：乙醚（6+4）f环己烷：乙酸乙酯（1+1）f氯仿：乙醚（8+2）f氯仿：甲醇（99+1）f苯：甲醇（9+1）f氯仿：丙酮（85+15）f苯：乙醚（4+6）f苯：乙酸乙酯（1+1）f氯仿：甲醇（95+5）f氯仿：丙酮（7+3）f苯：乙酸乙酯（3+7）f苯：乙醚（1+9）f乙醚：甲醇（99+1）f乙酸乙酯：甲醇（99+1）f苯：丙酮（1+1）f氯仿：甲醇（9+1）选择展开剂，要依据溶剂极性和他们的混溶性，溶剂对被分析物的溶解性，以及被分析物的结构。这里只讨论药典里通常使用的以硅胶为固定相主体的正相薄层，也不考虑板的活性。列出溶剂极性参数表，方便以下比较展开剂。环已烷：-0.2、石油醚（I类，30〜60°C）、石油醚（II类，60~90C）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇：3.9、正丁醇：3.9、四氢呋喃：4.0、氯仿：4.1、乙醇：4.3、乙酸乙酯：4.4、甲醇：5.1、丙酮：5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2[1]。关于溶剂混溶性，一般根据相似相溶原则，需要注意，极性相差大的不混溶，比如正己烷与甲醇。多元展开剂，主体的两种溶剂不能混溶，就需要通过第二种溶剂来调和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、环已烷和甲醇、水之类的。一般正相色谱，固定相为极性，被分析物质的极性越大，需要极性更大的展开剂。了解被分析物的极性可以通过分析其结构获得，很难获得它的极性指数。物质分子化学结构中，通常由较极性部分和非极性部分两部分。例如下面以苯丙烷为极性小部分，随着极性基团部分的增加，总体的极性就增加，展开剂极性也增加了。，依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。相应展开剂分别为：正己烷—乙醚—冰醋酸（5:5:0.1）、苯－冰醋酸－甲醇（30:1:3）、氯仿－甲醇－甲酸（9:1:0.5）、石油醚－乙酸乙酯－甲酸（3:6:1）、醋酸丁酯－甲酸－水（7:2.5:2.5）。（由于薄层板、比移值不同的原因，展开剂极性比较是相对的，并非绝对的后者大于前者）。现在最重要的问题是，不同化合物，怎么定它的极性，又用什么标准来定它对应的展开剂呢？以下分开讨论不同化合物极性情况及其对应的展开剂。首先是极性较小的挥发性物质。比如：冰片：石油醚（30〜60C）—醋酸乙酯（17:3）、厚朴酚：苯一醋酸乙酯（9:1.5）、a-香附酮：苯一醋酯乙酯一冰醋酸（92:5:5）、丹皮酚：环己烷－醋酸乙酯（3:1），这类化合物，以石油醚、正构烷和苯为体积百分数比较大的溶剂，通常起溶解和分离化合物的作用，而用醋酸乙酯为调节Rf（比移值）的溶剂。为了减少拖尾之类其他相似相溶原则以外的影响，适当加入添加剂，如有机酸或者有机碱。极性较小的不挥发性物质。比如：卩-谷甾醇：环己烷一醋酸乙酯一甲醇(625:1)或者环己烷－丙酮(5:2)、熊果酸：甲苯－醋酸乙酯－冰醋酸(12:4:0.5)、齐墩果酸：氯仿－甲醇(40:1)、猪去氧胆酸：氯仿－乙醚－冰醋酸(2:2:1)、大黄素：苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯一乙醇(8:1)、丹参酮IIA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4)、穿心莲内酯：氯仿-无水乙醇(9:1)、靛玉红、靛蓝氯仿－乙醇(9:1)或者苯－氯仿－丙酮(5:4:1)。这类物质展开剂极性比极性较小的挥发性物质洗脱力强一些，因为这类物质极性小的母核大，而极性大的基团通常可以形成氢键，比如羧酸、羟基。以上物质，母核分子量减小、母核结构中不饱和健的增加(尤其是出现苯环)，极性基团的增加，都使极性增加，展开剂极性也增大。这个范围内的物质很多，一般展开剂大百分数的溶剂可以从环己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的顺序，按照极性要求选择。这里注意，异丙醇、正丁醇极性指数也比较小，在这范围的化合物很少用，因为粘性大、展开慢，造成斑点扩散；另外，羟基的氢键作用力也有不利。调节Rf值的溶剂，从醋酸乙酯一〉甲醇一〉丙酮一〉乙醇。挥发性物质也有很多带羰基、羟基的，但从它的挥发性就可以明白，分子间作用力不强，另外，母核与石油醚、正构烷和苯的结构差异小，估计更容易脱离硅胶吸附，更快进入溶剂中，而不需要通过提高展开剂的极性。皂苷类。人参皂苷：氯仿一甲醇一水(65:35:10)10°C以下放置的下层溶液或正丁醇一醋酸乙酯一水(4:1:5)的上层溶液或氯仿一醋酸乙酯一甲醇一水(15:40:22:10)10C以下放置的下层溶液、芍药苷：氯仿－醋酸乙酯－甲醇－甲酸(40:5:10:0.2)、黄芩苷：醋酸乙酯－丁酮－醋酸－水(10:7:5:3)、橙皮苷：苯—醋酸乙酯—甲酸—水(1:12:2.5:3)的上层溶液、葛根素：氯仿－甲醇－水(14:5:0.5)、芦丁：醋酸乙酯－甲酸－水(8:1:1)。这类物质，由于存在糖的多羟基结构，苷元的结构影响变小。展开剂中使用极性大的有机溶剂(氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇)和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展开剂极性，另外也可以抑制硅胶羟基的作用，减少拖尾。由于混溶性和硅胶耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。极性大的小分子有机酸。没食子酸：氯仿－醋酸乙酯－甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、异绿原酸。这类物质多数是苯乙烯母核的，这个结构的极性本身比较大，另外有酚羟基和羧酸基团，个别有多羟基配基。皂苷的展开剂差不多，极性大。注意甲酸通常指的是浓度85%左右的，含有水。含氮有机物。盐酸小檗碱：苯－醋酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸气饱和)或正丁醇－冰醋酸-水(7:1:2)、麻黄碱：氯仿－甲醇－浓氨试液(20:5:0.5)或正丁醇一冰醋酸一水(8:2:1)、甘草酸铵：醋酸乙酯一甲酸一冰醋酸一水(15:1:1:2)。由于NH2硅醇基的作用很强，在强极性展开剂加有机酸、有机碱扫尾。对于极性化合物，使用正丁醇对斑点扩散影响较小，因为化合物和硅胶的作用强。进行薄层分析基本可以根据母核、基团，选择相似的化合物对号入座。当然，具体的条件优化则需要根据实际情况了。遇到较困难的分离，需要使用到设计优化方法的，已经不属于本文讨论范围了。章育中、郭希圣，薄层层析法和薄层扫描法，中国医药科技出版社，1990二、注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在1：5〜10,书中写硅胶量是样品量的30〜40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2〜0.4,杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cmX20cm的柱子）；如果相差不到0.1,就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。3、 关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。4、 关于湿法、干法上样湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。溶剂的选择。当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。5、关于操作问题。5.1装柱。柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！5.2加样。用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2〜4cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。5.3淋洗剂的选择。感觉上要使所需点在rf0.2〜0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。5.4样品的收集。用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。5.5最后的处理。柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚（60~90）,而乙醚却要选择30－60的石油醚。二是：不论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法将空气排干，这样就可避免柱中有空气！过柱子需要耐心，不要着急。三、重结晶、柱层析技术——多年经验总结经过任一反应所合成的有机化合物，一般总是与许多其它物质（其中包括进行反应的原料、副产物、溶剂等）共存于反应体系中，因此在有机制备中，常需要从复杂的混合物中分离出所需的物质。本人从事实验小试多年，总结经验如下：1、重结晶技术：重结晶是提纯固体有机化合物常用的方法之一。众所周知，固体有机物在任何一溶剂中的溶解度，均随温度的升高而增加，所以将一个有机化合物在某溶剂中，在较高温度时制备成饱和溶液，然后使其冷却到室温或降至室温一下，即会有部分成结晶析出。利用溶剂与被提纯物和杂质的溶解度不同，让杂质全部留在溶液或大部分留在溶液；当然，有时一开始析出的结晶也可能是杂质，而需要的组分则在溶液中。通过，上述我们知道影响重结晶纯化的重要因素是：溶剂的选择；热溶液的制备；冷却析晶（1）溶剂的选择溶剂选择的条件：a不与被提纯物发生化学反应；b溶剂沸点较低，易除去（常压、减压蒸馏除去）；c对所需组分在高温和低温条件下溶解度差异尽量大，而对杂质的溶解度要么很大，要么很小；d溶剂价格便宜、毒性小，容易回收，操作安全。（2） 热溶液的制备很多人认为，制备热溶液就是将溶液加热至一定温度，然后将要结晶的混合物溶解其中。其实，热溶液的制备还是有很多的讲究的。根据经验我认为首先，必须先了解选用的溶剂的沸点，热溶液的温度应同其沸点有一段距离，否则溶剂挥发量太大，不仅影响重结晶效果，还会危害身体健康；其次，热溶并不是一口气加入混合物使其溶解，最好的操作应该是在升温的过程中不断的搅拌加入混合物，使其饱和。（3）冷却析晶通常可分为常温（室温）、低温析晶两种。至于采用哪种方法则决定于结晶速度的快慢，晶形要求等因素。如果，结晶速度快，一般采用常温（室温，自然冷却）结晶，而对于一些有特殊要求（如，不易结晶，结晶慢等）可采用低温结晶方式（先自然冷却至室温，至于冰箱保鲜层缓慢降温）。一般来说，我们希望在最短的时间里得到结晶，常采用非常手段（如，至于冷水中，冷却过程中加以振摇），这要是可以加快结晶速度，但是它也带来很大的弊端。因为，快速冷却，振摇得到的结晶大多较细，表面积大，吸附母液多，且容易夹有杂质（快速结晶中杂质包裹在晶体中）。所以，最好是采用自然冷却。当然，加快结晶的办法也是有的：用玻璃棒摩擦瓶壁；加入少量晶种引晶。（4）结晶的过滤和洗涤将析出的结晶的冷溶液和结晶的混合物，用抽滤法分出结晶；瓶中残留的结晶，可用少量滤液冲洗几次，一并转移至布氏漏斗，把母液尽量抽干；用刮刀、空心塞把结晶压紧，以便抽干结晶吸附的含杂质的母液；用适量的洗涤液清洗2〜3次，可用玻璃棒或刮刀轻轻搅动。（5）结晶的干燥若重结晶的溶剂是石油醚等低沸点溶剂可放于通风厨中自然凉干（不吸水的前提下），如果是乙醇等沸点较高的溶剂一定要在高于其沸点10°C的烘箱中放置1〜2小时（低于结晶熔点20°C以上）。干燥至恒重后，及时至于干燥器中保存待用。（6）操作案例取l.OOg4—羟基脯氨酸，在升温条件下（升温至55〜60°C）加入到乙醇（95%）中，边用玻棒搅拌溶解，室温放置，自然冷却（可用玻棒轻轻摩擦瓶壁），有结晶析出，冷却至室温，布氏漏斗抽滤，空心塞压紧，水少量洗涤，压紧抽干，烘箱升温至100C,干燥1小时至恒重，测熔点（熔距短），干燥器中存放。2、柱层析技术：柱层析通常可分为：干柱色谱和湿柱色谱两种。这里我将介绍最常用的湿柱色谱以下习惯称柱层析。化学反应中得到的产物中通常混有反应物、副产物、溶剂（统称杂质）的，为进行数据测试或则杂质在对下一步反应有影响，这时我们就得尽量的除去这些杂质。固体结晶可通过上述的重结晶方法进行纯化，但对在要求较高时通过重结晶得到的纯度显然无法满足要求；而且对于液体（油状物）这一类产物时又不可能通过柱层析进行实现。这时，就需要采用柱层析的方法进行纯化处理以期获得合格的化合物。将白了，柱层析就是利用不同物质在洗脱剂中的展开速度不同（跑的快慢曾读）而进行分离。目前，我们最常用的就是以硅胶、氧化铝两种物质为填充剂的色谱柱，常称为：硅胶柱和氧化铝柱。这里我们重点介绍便宜且工业化应用广泛的硅胶柱。首先，就是确定选用哪种直径的柱子进行柱层析操作。通常实验室采用直径在0.5〜10cm的柱子，柱高50〜70cm。这时就得根据你要过柱的量来选择了，通常v0.8g—般采用2.0左右的柱子；2.5cm的柱子用于0.8〜2.5g样品的过柱；3.5、4cm的柱子用于2.5〜5g；6cm的柱子一般用于＞5g的混合物。其次，选择好要用的柱子后就得考虑采用的填料，一般实验室内都采用硅胶填料。硅胶用量差不多为分离物质量的40倍左右，当然，这也不是绝对的。如果只是用来普通的过滤用用量就可以少下来。一般用度来算的话，就是装柱量在25〜30cm为宜（纯属本人经过几百根柱子下来的经验），太长则分离时间太久，短了分离效果不好。接下来就是考虑如何装柱了，通常一般实验室内很少碰上无水、无氧柱，大家接触多的是普通柱。本人觉得湿装柱屡试不爽，具体操作就是，先往柱中放入少量棉花，加入少量沙子（普通，清洗干净）加入一定量的洗脱剂，把硅胶溶解于洗脱剂中装柱，用吸气球加快硅胶沉淀，再在硅胶上层加入少量沙子形成沙层（lcm左右），这样一根柱子就装好了。然后就是上样（你的样品需要先浓缩蒸掉大部分溶剂剩下少量刚好成溶液有一定的流动性，用胶头滴管上样），上样完就可以开始洗脱了，（如果你的样品是有荧光的那你可以先用薄层板展开，知道所要的产物点的Rf值及杂质点的Rf值这样就能够很好的配制洗脱剂的极性程度，因为薄层板跟硅胶色谱柱的原理一样可以在薄层板展开剂的基础上稍微的调整一下极性比例），刚开始洗脱时可以采用石油醚等极性小的溶剂先进行冲洗然后再用配好的洗脱剂进行洗脱，可以用吸气球进行人工加压，加快洗脱速度。溶液接收及检测：一般采用几个三角瓶（锥形瓶）进行收集，通过薄层板（有荧光时，若没有荧光看一下有没有色带收集色带，如果二者都没有那你有点麻烦）判断要的产物下来没有，下来后开始可以少量收集，接下来收集量大一点，快没荧光时收集量小一些，对收集的几瓶子洗脱液进行薄层展开，合并同一高度的溶液，浓缩，经过这样的掐头去尾就可以得到符合要求的样品了。再给大家一个本人操作的案例一个：取某样品3.80g柱层析；柱子：^35x26硅胶（300〜400目）200m1,石油醚装柱，少量二氯甲烷溶解，上样。洗脱，石油醚150m1+洗脱剂（石油醚:丙酮二4:1）60m1x8。薄层板展开显示3、4、5样品为所需样品，合并，浓缩得黄色油状物1.22g。四、柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。首先谈柱层析：1装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。湿法装柱：是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗齐『走柱子〃，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。干法装柱：则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂''走柱子〃，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于'走柱子〃时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂''走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。2：上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。谈TLC，需要切记的是：第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开■一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。第二、点不能点得太浓,否则容易重叠，不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个交好的分离效果。选择适当的展开剂是首要任务■一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷V己烷<苯<