茶树育种学第八章-分子育种课件

第八章：分子育种第一节：基因工程与育种一、基因工程的概念应用人工方法把生物的遗传物质（通常是DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变他们的遗传特性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物，这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程就是基因工程，也称DNA重组技术。第八章：分子育种第一节：基因工程与育种1二、植物基因工程的方法和步骤（一）目的基因的分离和克隆1、基因芯片技术基因芯片是把生物活性大分子（如核酸和蛋白质）或细胞等密集排列固定在固相载体（如硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜）上，所形成的微型检测器。基因芯片技术就是利用特异性的分子间相互作用，如核酸杂交、抗原-抗体特异结合、蛋白质-蛋白质间特异结合等，将待测样本标记后与生物芯片反应，通过激光共聚莹光扫描仪等检测手段获得信号，经电脑系统处理、分析得到信号值，以次来检测样本的结构和性质。因此，可利用基因芯片技术从基因组中发现或找出某个目的基因。二、植物基因工程的方法和步骤22、基因文库技术基因文库是指汇集和克隆了某一基因组所有DNA序列的DNA群体2、基因文库技术3（二）目的基因的转化1、基因的转化的作用⑴创造新品种。⑵研究基因表达或用于基因作图和基因克隆。2、基因的转化的条件⑴有适宜的目的基因。⑵有适当的组织培养系统。能脱分化和再分化．⑶有适当的转化途径和方法。要求损失小，频率高，且外源基因能稳定地整合到基因组，并且具有正常的时空表达能力．（二）目的基因的转化43、目前植物基因转化的方法⑴农杆菌介导的基因转化法。①原理。在自然条件下，农杆菌通过伤口侵染植物，并广泛寄生于双子叶植物中。农杆菌中存在一种与肿瘤诱导有关的质粒，即Ti质粒。该质粒能够把本身的一段DNA转移至植物细胞，整合进植物基因组得以表达，并能够通过减数分裂传递给后代。可转移的DNA片段称为T-DNA。T-DNA的转移与边界序列有关，而与T-DNA区段的其他基因或序列无关，因而，可将T-DNA区段上的无关序列去掉，插入外源目的基因，当农杆菌3、目前植物基因转化的方法5侵染植物时，将目的基因转移到植物中去。②转化过程：受体系统的建立→Ti质粒转化载体的构建→目的基因的转化。③转化方法：整体植株接种共感染法；叶盘转化法；原生质体共培养转化法。⑵化学和物理诱导DNA直接转化①聚乙二醇（PEG）法。（原生质融合）②脂质体法。用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。侵染植物时，将目的基因转移到植物中去。6③电击法。④超声波法。⑤显微注射法。⑥激光微束法。⑦基因枪法。⑶种质系统介导的基因转化种质系统介导的基因转化也称生物媒体转化，即通过植物的生殖系统的细胞以及细胞结构将外源DNA转入宿主植物中去。③电击法。7①花粉管通道法。②生殖细胞浸泡法。③胚囊、子房注射法。4、基因转化方法的评价⑴农杆菌介导的基因转化法的转化频率高，周期短，可以转移大片段DNA而被广泛使用。但其受体植物只是双子叶植物。⑵化学和物理诱导DNA直接转化法不受宿主植物的限制，应用广泛，但成本较高，转化频率也不如农杆菌高。①花粉管通道法。8⑶种质系统介导的基因转化法简单易行，但成功率低。（三）转基因植株的鉴定１、转化植株的再生．目的基因的直接受体一般是细胞或组织，在鉴定目的基因被导入与否，先要诱导这些细胞或组织再分化，形成转化植株．２、转基因植株的鉴定⑴分子生物学鉴定．主要是通过分子杂交来鉴定，包括southern杂交、northern杂交、western杂交．⑵性状鉴定．即外源基因在宿主植物表达的鉴定⑶种质系统介导的基因转化法简单易行，但成功率低。9，如果是无性繁殖，外源基因表达要在下一代稳定表现，如果是有性繁殖，外源基因表达则要在后代稳定表现．三、基因工程的安全性评价（一）安全性评价的意义生物安全性评价就是要对生物技术（主要是基因工程）活动本身及其产品，可能对人类和环境的不利影响及其不确定性和风险性进行科学评估，并采取必要措施加以管理和控制，以保障人类健康和环境安全．，如果是无性繁殖，外源基因表达要在下一代稳定表现，如果是有性10（二）转基因植物安全性评价２００２年我国农业部发布了《农业转基因生物安全评价管理办法》，将农业转基因产品的生产、加工活动对转基因生物安全等级的影响分为三种类型（即：增加转基因生物的安全性；不影响转基因生物的安全性；降低转基因生物的安全性。），并根据农业转基因生物的安全等级和产品生产、加工活动对其安全等级的影响类型和影响程度，将转基因产品分为四个安全等级．（二）转基因植物安全性评价11（三）转基因植物各阶段安全性评价申报要求转基因植物生产分为五个阶段，即：立项→中间试验→环境释放→生产试验→安全证书申报．在各个阶段都要进行安全性评价申报，通过安全性评价后才能进行下一阶段的试验或生产．每次申报都要提交相关材料，如在立项阶段必须提交：实验研究报告书；农业转基因生物的安全等级和确定安全等级的依据；相应的实验室安全设施、安全管理和防范措施。在申报安全证书之前，必（三）转基因植物各阶段安全性评价申报要求12须提交：安全评价申报书；农业转基因生物的安全等级和确定安全等级的依据；农业部委托的农业转基因生物技术检测机构出具的检测报告；中间试验、环境释放和生产性试验阶段的试验总结报告；其他有关材料。须提交：安全评价申报书；农业转基因生物的安全等级和确定安全13第二节：分子标记与育种一、常用分子标记的原理和方法（一）分子标记的概念１、遗传标记。是指基因型特殊的易识别的表现形式。包括形态标记；细胞标记；生化标记和分子标记。形态标记简单直观，但数量少、多态性差、易受环境条件影响；细胞标记和生化标记经济方便，但标记数有限。2、分子标记。是指基于DNA水平多态性的遗传标记，它通过检测基因组的一批识别位点来估测基因组变异性和多样性。3、分子标记的特点第二节：分子标记与育种一、常用分子标记的原理和方法14⑴是在DNA水平上对遗传变异的直接反映，不受季节和环境的影响，也不受基因表达与否的限制。⑵多态性高。⑶大多数分子标记是共显性的，使对隐性性状的选择成为可能，鉴别出纯合基因型与杂合基因型。目前用于辅助育种的分子标记主要有限制性片段长度多态性（RＦLP）；随机扩增片段多态性（RAPD)；扩增片段多态性（AFLP)和简单重复序列（SSR).⑴是在DNA水平上对遗传变异的直接反映，不受季节和环境的影响15(二）ＲFLP标记限制性片段长度多态性（RＦLP）是用各种限制性酶将DNA分子剪切成不同大小的片段。由于突变、重组等原因，不同种属、甚至同一品种的不同个体，对同一内切酶来说，切位点和切位点之间的DNA序列都有可能不同，当用限制性内切酶处理不同生物体的DNA时，就会产生不同长度DNA片段，这就是RFLP。RFLP标记先用限制性内切酶酶解目标DNA，用电泳的方法将DNA片段分开，再通过southern印迹分析各片段的核苷酸序列及其差别．进而为生物进化、亲缘关系以及遗传育种提供依据．(二）ＲFLP标记16（二）RAPD标记随机扩增片段多态性（RAPD）是建立在DNA序列体外酶促扩增的多聚酶链式反应（PCR）的基础上的RAPD标记，其基本原理是采用人工合成的较短的随机排列碱基顺序核酸单链为引物，在一种热稳定DNA多聚酶作用下，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，获得一组不连续的DNA片段。其中每个扩增所产生的片段代表了基因组上的一个位点，所检测出来的扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。（二）RAPD标记17RAPD标记具有操作简单、引物无物种限制、多态性丰富、可采取自动化操作，提高工作效率等特点而被广泛运用。RAPD标记在育种中用于重要性状的分子标记；图谱绘制、杂种纯度鉴定等。在茶树育种方面，有人运用RAPD标记进行亲子关系鉴定；茶树遗传多样性分析；无性系突变体鉴定等。RAPD标记具有操作简单、引物无物种限制、多态性丰富、可采取18（三）AFLP标记AFLP标记是用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后对限制性片段进行选择性扩增，从而揭示DNA多态性。该技术的特点是信息量大，一次反应可检测到上百个位点，而且得到的谱带的大多数片段与基因组的单一位置相对应，故可用于遗传图谱和物理图谱的构建，此外，还可用于增加染色体特定区域的饱和性分析；回交群体遗传背景分析；种质鉴定和遗传多样性分析等等。（三）AFLP标记19（四）SSR标记(simplesequencerepeats)SSR标记是利用真核生物的基因组中普遍存在1~6个bp简单串联重复特性作为分子标记，生物个体不同，简单串联重复的核酸序列也不同，从而构成生物多样性．由于每个简单重复序列两端的碱基组成基本是相同的，因而可根据两端的序列设计一对特异引物，扩增每个位点的简单重复（微卫星）序列，进而分析生物多样性．SSR标记广泛用于连锁图谱的构建和种质资源遗传多样性的研究．（四）SSR标记(simplesequencerepea20二、分子标记在育种中的应用（一）构建遗传图谱。建立高密度分子遗传图谱，定位与目标性状紧密连锁的分子标记，有助于在茶树生育早期对群体中含有目标基因植株进行选择，从而大大提高育种效率，缩短育种周期．（二）分析亲缘关系．借助分子遗传图谱可为品种资源和鉴定和保存，研究植物的起源与进化，远缘杂交亲本的选配，预测杂种优势等提供理论依据．二、分子标记在育种中的应用21（三）分子标记辅助选择．１．在亲本选择上，传统的选择是基于田间表现型的选择，而不是对基因型的选择，但表型是基因型与环境互相作用的结果，许多性状与基因间并非一对一的线性关系．因此，依表型来推测基因型并不总是可靠的或是比较困难的，不仅需要丰富的实践经验，而且还受到许多外在条件的限制，而分子标记辅助选择则可以避免这些限制．２．可以在细胞水平和植株早期发育阶段进行鉴定，找到含有目标基因或不良性状基因的植株，早期鉴定，早期分离，早期培育，缩短育种周期．（三）分子标记辅助选择．１．在亲本选择上，传统的选择是基于田22思考题：１、将外源基因转化到植物中去的必要条件是什么？２、进行基因转化的途径有哪些？它们各有何特点？３、转基因植株的鉴定方法有哪些？４、什么是遗传标记？遗传标记包括哪些不同层次的标记方法？它们各有何特点？５、如果你已获得能抗某一主要害虫的基因，如何将该基因转化到茶树体内？试述主要步骤和方法？思考题：23６、分子标记在茶树育种中的应用有哪些？７、分子标记辅助选择在茶树早期鉴定中有何重要意义？８、常用的分子标记技术有哪些？各有哪些特点？６、分子标记在茶树育种中的应用有哪些？24单倍体育种的优越性1.控制杂种分离,缩短育种周期常规杂交育种,自花授粉植物从选择亲本开始,经杂交、分离、选择、稳定品质4~6代,加之品比、生产试验、区域试验需8~10年时间;异花授粉植物的育种周期更长,仅稳定品系就要6~7代自交.而对一些异花授粉的树木而言,这个过程更长,例如茶树至少要20年以上,正因为如此,很少有人用常规杂交育种的办法要选育有性茶树品种.如果采用单倍体育种,则能够在较短时间(3~5年)获得纯系,而选育有性茶树品种打下基础.从而缩短育种周期,杂交有性品种的可能性.单倍体育种的优越性1.控制杂种分离,缩短育种周期25茶树育种学第八章--分子育种课件262.排出显、隐性基因干扰,提高选择效率常规育种单倍体育种亲本基因型AAbb×aaBBAAbb×aaBBF1配子基因型AaBbAaBbF2配子基因型2.排出显、隐性基因干扰,提高选择效率272.单倍体是研究遗传变异的好材料,这点对茶树育种至关重要.由于茶树是多年生异花授粉植物,要搞清楚其遗传变异难度很大,这也制约了茶树育种技术和手段的发展.如杂交育种,转基因,抗性育种,品质育种等等.3.单倍体是诱变育种的好材料,因基因相对纯合.单倍体植株经诱变后,所以突变范围的高化发送都能在当代表现出来,而其它倍数体植株在诱变处理后,某些突变隐性基因所控制的性状变化则不能在当代表现出来,增加选择难度.2.单倍体是研究遗传变异的好材料,这点对茶树育种至关重要.由284.克服远缘杂交不孕或不结实.主要原因是遗传差异大,染色体难以配对,利用单倍体对栽培品种进行提纯复状,对基因型混杂的品种,经单倍体加倍成纯合二倍体,再选择具有原品种优良特性特征的植物大量繁殖推广,达到提纯复状的目的.对茶树育种而言:一是缩短育种周期,二是便于资源现场研究,为育种打下基础.4.克服远缘杂交不孕或不结实.主要原因是遗传差异大,染色体难29第二节单倍体育种一、植物单倍体的概念植物在减数分裂时形成雄、雌配了,其染色体数目为体细胞的一半,将这种具有单套染色体的细胞称为单倍体细胞.单倍体细胞在人工离体条件下培养,使其单性发育成植物体,这种具有单套染色体的植物称为单倍体植物.第二节单倍体育种一、植物单倍体的概念30二、单倍体育种的概念:将具有单套染色体的单倍体植物,经人工染色体加倍,使其成为纯合二倍体.从中选育出符合人们需要的个体,直接繁育成新品种,或选出具有单一优良性状的个体,作为杂交育种的原始材料,称为单倍体育种.二、单倍体育种的概念:31花药培养的概念花药培养就是以植物花药为材料,通过组织培养形成愈伤组织,再经过诱异分体形成完整植株的过程.由于花药培养的主要目的是获得单倍体植株.因此,人们也把花药培养称为单倍体植株培养.花药培养的概念32单倍体育种的优越性(见第一节内容)单倍体育种的优越性(见第一节内容)33非均等分裂五、花粉单性发育的生物学原理及离体培养条件下小孢子发育成植物体的途径单核小孢子营养核生殖核营养细胞生殖细胞愈伤组织多细胞花粉粒单倍体植株胚状体非均等分裂五、花粉单性发育的生物学原理及离体培养条件下小孢子34六、单倍体植物的培养程序及关键技术①顺利通过消毒灭菌关②花粉发育时期的鉴定和选择用于研究遗传的可选用一些具有典型发送的品种,用于培养新品种则选择结合性较好的品种的花药.选择花药发育的单核花粉后期.③确定是否低温处理和糖处理材料准备六、单倍体植物的培养程序及关键技术35①基本培养筛选选用SJ—1和N6培养基(见P163)②植物激素种类和浓度筛选③糖浓度(渗透压)筛选接种→脱分化→愈伤组织→再分化→化苗诱导花粉脱分化分裂①基本培养筛选选用S36①花粉愈伤组织分化,植株再生(激素种类及浓度调节)取形成愈伤组织60天以上,直径在2~3mm左右且为第一代愈伤组织作再分化材料②胚状体壮苗培养:a.调节基本培养基b.降低激素和渗透压用N6培养基(见P165)分化培养和壮苗培养①花粉愈伤组织分化,植株再37①调节基本培养基,无机盐浓度下降②调节激素浓度和种类③调节糖浓度(渗透压)关键是生长素与细胞激素之比,适中则脱分化,比值高则有利于长根,比值低则有利于长芽完成植物体形成①调节基本培养基,无机38①试管菌驯化,渗透压变化和光照强度变化②移植营养土配制③保持高空气湿度(80~90%,1~2周)和低土地湿度.④用5%可湿性多菌消毒驯化与移载①试管菌驯化,39①形态鉴定②细胞学鉴定③交配鉴定④分子标记鉴定花粉植株鉴定①形态鉴401.形态鉴定:①外形:植株瘦小,叶片窄小,花小柱头长.②结实性:开花,不结实.③花粉粒着色和大小,花粉粒败育,不着色2.细胞学鉴定.取根尖细胞镜检染色体数目1.形态鉴定:414.分子标记鉴定:①同功酶,分析比较处理前后再生后植株的同功酶.②限制性片段长度多肽性(RFLT技术),时间长,费用高.③随机扩增多肽性(RAPD).运用单个或多个随机引物(长度为10个或多重百个核苷酸)经多聚酶链式反应,酶促扩增特异性DNA片段.从而得到多态性图谱.RAPD与PFLT比较,具操作简便,速度快,成本低,检出率高的优点.4.分子标记鉴定:42七、单倍体植物的染色体加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:①小菌浸泡法.将再生小植株从试管移出,在无菌条件下用秋水仙素溶液浸泡,再转移到新鲜的培养基去培养.②处理生长锥,醮满秋水仙素溶液的棉球置于顶芽或腋芽③培养基加倍,在培养基加入一定浓度的秋水仙素.七、单倍体植物的染色体加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:43八、茶树花药培养及展望存在的问题1.诱导效率低2.体细胞(花药、药壁、药隔)干扰问题3.目前培养基成分带有一定睛的育成性八、茶树花药培养及展望存在的问题1.诱导效率低44第三节体细胞杂交一、体细胞杂交的原理及定义体细胞杂交也称细胞融合.实质是两团来自不同亲本的原生质体的融合.原生质体是除去细胞壁的裸露细胞-------原生质体的概念.原理:已知植物细胞壁上,具有粘性很强的核酸酶.核酸酶可阻止外源DNA进入植物细胞,除去细胞壁后,可避免核酸酶对异体DNA的破坏.从而使胞质融合和转基因成为可能.第三节体细胞杂交一、体细胞杂交的原理及定义45长期以来的有性杂交方法所进行的遗传物质交换(基因重组)有如下局限性:1.同源性(自交不亲合)和异源性(杂交不亲合)限制了有性结合范围.2.由于配子形成是减数分裂的先导.而在减数分裂时,由于染色体的易位,例位、重复、缺失行为而引起染色体数目减少或增加.因为杂交后代不可能具有完整的遗传信息.而原生质体是研究遗传理论的好材料.如核质关子,杂交或自交不亲合性的机理以及激素作用机理等.长期以来的有性杂交方法所进行的遗传物质交换(基因重组)有如下463.大多数高等植物,重组只限于染色体基因(核基因),而雄配子体细胞胞质基因不可能遗传给下一代.而体细胞杂交能克服上述局限.如扩大“杂交”范围,创造植物新物种和新品种,如固N作用,高光数,抗病虫等.有利于遗传研究.1.克服不亲合性,扩大“杂交”范围,创造新品种2.有利于研究细胞质遗传3.大多数高等植物,重组只限于染色体基因(核基因),而雄配子47二、体细胞交杂的程序①双亲原生质体制备②酶法分离原生质体.纤维素酶,果胶酶③影响原生质体活力的各种植物原生质体分离二、体细胞交杂的程序48①采用界面法纯化原生质体②筛网过滤③质膜稳定剂和渗透压稳定剂双亲原生质体混合液制备:双亲原生质体以等体积,等密度(104~105个细胞/ml)混合,制备成混合亲本原生质体.原生质体纯化①采用界面法纯49①融合法②高钙和高PH值法③聚乙二醇法④聚乙二醇和高钙,高PH值结合法.原生质体融合原生质体50

①互补选择法:白化互补,遗传互补,营养互补.局限性大②可见标志选择法:凹穴培养皿法,微吸管法.直观而多使用.细胞杂种的选择细胞杂种51①基本培养基筛选②激素种类和浓度调节③渗透压调节愈伤组织形成,器官分化,植株再生愈伤组织形成,52①与亲代形态特征比较②杂种植物核型分析③同工酶谱分析杂种植株鉴定杂种植株53影响原生质体活力的因素:①细胞壁降解酶的种类及组合②渗透压稳定剂,即在分离前使用的高渗糖液(如甘露醇)使质壁微离且胞质成团③质膜稳定剂如0.2~0.3%,葡聚糖硫酸钾能降低酶液中的核酸酶活力,保护原生质膜;0.1mmol/LCaCl2(氯化钙)中的钙离子能稳定原生质膜并有利于细胞分裂.④PH值影响原生质体活力的因素:54⑤温度因子⑥植物材料的生理状态,如株龄、发育状态、栽培条件(营养、光照、温度25~26℃等)对取材影响很大,需累积实践经验⑤温度因子55原生质体融合法:①盐类融合法:硝酸盐类:NaNO3,Ca(NO3)2等.氯化物类:NaClCaCl2BaCl2,葡聚糖硫酸盐类.优点为:对原生质体活力影响较小,但融合成功率低②高钙和高PH值融合:Ca2+浓度在0.05mol/L左右.PH值在9.5~10.5之间.③聚乙二醇融合法(PEG法),PEG处理40~50min,再用培养液稀释并逐步洗去PEG④聚乙二醇与高Ca2+,高PH值结合法原生质体融合法:①盐类融合法:硝酸盐类:NaNO3,Ca(N56步骤:先用PEG处理30min,再用高钙和高PH值液稀释PEG,最后用培养液洗去高Ca2+和高PH值.PEG是相邻原生质体表面间的分子桥,当PEG分子被高Ca2+,高PH值洗掉是,可能引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布,从而促进融合.步骤:先用PEG处理30min,再用高钙和高PH值液稀释PE57它是指在某一光强度时,光合作用中所吸收的CO2与呼吸作用所释放的CO2达到动态平衡,这时光照强度称为光补偿点.现在空间中CO2浓度约为330mm.作物群体内部及附近则更低,远不能满足作物光合作用的需要.故CO2补偿点低的作物一般光合效率较强.而光饱和点和光补偿点则反映植物化的一些特征和环境的适应能力.一般而言,光饱和点较高的植物,其光合效率较高.它是指在某一光强度时,光合作用中所吸收的CO2与呼吸作用所释58茶树是C3植物,其CO2补偿点较C4植物要高,但个体之间有差别,茶树是耐荫植物,光饱和点较低(42000~55000米烛光),光补偿点较低(300~500米烛光).茶树是偏荫性植物,光补偿点和饱和点前比较低.因此,在生产实践中,可通过选择哪些叶色深,叶肉厚,叶绿素含量高,分枝角度小,叶片较直立.CO2补偿点较低,光饱和点较高,光呼吸较弱的个体,来提高其光合能力和受光,协调叶面积和受光时间,降低呼吸消耗,提高生物产量.茶树是C3植物,其CO2补偿点较C4植物要高,但个体之间有差59三、茶树高光效育种的方法1.株型选择法①依据,不同的植株的株型结构,具有不同的最佳叶面指数及受光能率,从而能提高受光面积和受光时间,达到提高光合效率.②内容指标.A.分枝结构的选择,选择那些分枝角度较小(一般小于45度),层次分明且分枝均匀的树型.

三、茶树高光效育种的方法1.株型选择法60B.叶的选择.选择那些颜色深绿,叶较直立(夹角不于45度,最好在30度以内),叶肉厚,比叶重大.比叶重(SLW)=总叶重mg/cm2总叶面积中国茶科所等人测试了7个品种的比叶重差异在12.63~19.84毫克CO2/分米2/n有效光合强度与比叶重呈强正相关.相关系数为0.88.B.叶的选择.选择那些颜色深绿,叶较直立(夹角不于45度,最61则可缓解这种制约关系.此外,较直立的叶片受强度直射时间短,而受弱光直射时间较长,而式中叶的光合能力受到叶片构造及其生化成分的影响.比如叶色深绿,叶肉厚,叶绿素a/b值高,叶片维管束鞘细胞发达,这样叶片结构的植物光合能力强,而通过PEP(磷酸烯醇丙酮酸)羟化酶来固定CO2的植物比通过RUDP(二磷酸核酮糖)羧化酶来固定CO2的植物的光合能力要强(前者叫做C4植物,后者叫做C3植物)则可缓解这种制约关系.此外,较直立的叶片受强度直射时间短,而62而植物的呼吸消耗又包括暗呼吸和光呼吸两种方式.前者是无光条件下植物的呼吸作用,而后者则是在有光条件下的植物呼吸作用.一般而言,呼吸作用是植物生命活动一部分,它不仅给植物生长发育提供能量(ATP),而且还给植物的生物合成提供能量,是植物生成代谢中必不可必的过程.但是暗呼吸和光呼吸是不同的前者是碳水化合物(糖类及淀粉)作为氢化底物,在呼吸过程中形成ATP(三磷酸腺苷).而植物的呼吸消耗又包括暗呼吸和光呼吸两种方式.前者是无光条件63而后者呼吸氢化底物是光合作用中的中间产物乙醇酸.且氯化过程不形成或很少形成ATP.所以它是一个消耗能量的过程,但光呼吸是在环境中低CO2和高O2以及强光情况下,对叶绿体的光合作用中心有保护作用.所以,从一定意义上来说,暗呼吸是必需的,而光呼吸则植物为适应环境条件的自我调节.而且人们还发现,一些C4植物的光呼吸非常弱.几乎只进行暗呼吸,而C3植物的光呼吸则比较强,所以C4植物的光合效率比C3植物强.而后者呼吸氢化底物是光合作用中的中间产物乙醇酸.且氯化过程不64除了光呼吸强度以外,还有两个指标也反映了植物的光合能力.一个是CO2补偿点,另一个是光饱和点.前者是在光下,植物光合作用中所吸收的CO2量与呼吸作用中所释放的CO2量达到动态平衡时,环境中CO2的浓度.光饱和点是指植物的光合强度随光照强度的增加而增加.当光照增加到某个数值(点位)时,光合强度不再随光照强度的增加而增加.这个光照强度数值(点位)就称为该种植物的光饱和点.对应地,也有光补偿点.除了光呼吸强度以外,还有两个指标也反映了植物的光合能力.一个65第四节茶树高光效育种一、茶树高光效育种的基本概念茶树高光效育种就是根据茶树某此生理生化及形态指标,来选择光合作用效率高,特别是净光合率高的茶树个体,进而培育成茶树新品种的过程.第四节茶树高光效育种一、茶树高光效育种的基本概念66二、茶树高光效育种的意义和基本原理1.意义:茶叶最高单产可能达到多少?若以茶树对光能的利用率来推算.印度学者推算当地的茶叶生物产量可达到12,000~16,000斤/亩.经济产量2666斤/亩~3333斤/亩(经济子数21%左右).东非茶叶研究所(肯尼亚)的研究人员则推算,当地完全覆盖的茶园,生物产量可达到32000斤/亩.经济产量达到3200斤/亩.(经济子数10%).二、茶树高光效育种的意义和基本原理1.意义:67我国学者以长沙地区为例.推算我国茶叶生物产量可达6930.23公斤/亩.经济产量可达1455.35公斤/亩≈2900斤/亩.实际上,地处炎陵县的湖南?江茶场.最高产量为1072斤/亩.只有理论产量的37.08%.即使我国有最高单产记录广东英德红星茶场9.25亩平均601公斤/亩.其中一亩达705公斤/亩.也只有理论产量的48.44%.所以说,茶叶增产的潜力还很大.那么如何进一步提高茶叶产量呢?我国学者以长沙地区为例.推算我国茶叶生物产量可达6930.268一些学者认为.最好有效的方法是通过茶树高光效育种来提高整体茶树的光合效率,进而提高生物产量和经济产量.因为目前作用的光能同化率很低.光能同化率指单位面积的太阳辐射能被转化为化学能之比.多数在1%~2%之间.有些尚不到1%,而研究表明,作物的光能利用率,最大的理论值可10%~20%.实际上,我国平均茶叶产量在50公斤/亩左右.其光能利用率仅为0.25%.而亩产1000斤的茶园,其光有利用率也只有2.5%.如果将光能利用率提高到5%,并按20%的经济系数推算,茶园产量可达947kg/亩.可见,通过提高茶树光能利用率来提高茶叶产量的潜力还是很大的.一些学者认为.最好有效的方法是通过茶树高光效育种来提高整体茶692.基本原理要了解高光效育种的基本原理.首先必腼了解植物的光合作用.光合作用就是绿色植物在阳光照耀下,由细胞内的叶绿体吸收太阳光能,经过一整套物理,化学反应“工序”.把从环境中吸收来二氧化碳与水合成有机物质,贮藏能量并放出氧气的全过程.可用下列化学方程式来概说地表示:CO2+H2O→(CH2O)+O22.基本原理要了解高光效育种的基本原理.首先必腼了解植物的光70因此,光合作用不仅受到CO2,H2O,光等环境影响,而且还受到绿色植物本身的影响,不同的结构,其光能利用效率不同.植物的光能利用效率可用植物的生物产量来表示,而植物的生物产量又由光合产物总量和呼吸消耗总量两个变量构成.即生物产量=光合产物总量-呼吸消耗总量而光合产物量=叶面积×叶的光合能力×叶的受光效率×光合时间式中,叶面积与叶的受光效率之间有相互制约的关系.因此,光合作用不仅受到CO2,H2O,光等环境影响,而且还受71一般而言,叶面积少,叶的受光效率高,反之亦然.但如果叶片比较直立,树冠分枝比较小.2.光呼吸筛选法①依据.CO2补偿点低的植株,其光呼吸也比较低,呼吸消耗较少,同时光合效能比较高.②方法.将不同选择材料的植株,与一些C4植物的植株一同栽在一个照光的密闭系统内(如塑料膜棚或玻璃房)内,使系统内的CO2浓度降低到一浓度,观察各植株反应,从而筛选出那些CO2补偿点较低的植株,进而培育成高光效新品种.一般而言,叶面积少,叶的受光效率高,反之亦然.但如果叶片比较723.基因改造在光合作用中，低光效的植物中二磷酸核酮糖羧化酶（ＲＵＢＩＳＣＯ）固定（ＰＥＰ）羧化酶固定ＣＯ2，在现代遗传工程中，有人试图将控制磷酸烯醇丙酮酸的基因导入一些Ｃ3植物．从而形成高光效品种．也有人将不同来源的ＲＯＤＰ（二磷代？酮糖羧化酶）的基因导入同一植物，形成异源亚基的ＲＵＤＰ基因（基因杂交）．或采用定点突变基因技术来诱导ＲＵＤＰ基因变异等办法来提高植物对ＣＯ2的固定效率，从而提高植物的光合效能．3.基因改造73第五节植物的遗传转化（转基因植物的形成）一.植物基因转化的受体作为转基因的受体植物，必须满足2个条件：①能够接外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源基因稳定地插入植物染色体中．②必须有脱分化和再生能力，能够形成新的植物体．第五节植物的遗传转化（转基因植物的形成）一.植物基因转化的74而植物转基因的受体通常是原生质体，悬浮细胞，胚性愈伤组织，胚状本，叶园片（叶盘）．即新鲜无菌幼嫩叶片，打片3～５ｍｍ的叶圆片．此外，还有其它受体．如子叶，胚轴，茎段，根，体细胞胚，花粉等．而植物转基因的受体通常是原生质体，悬浮细胞，胚性愈伤组织，胚75二.植物基因转化常用酶1.核酸酶．是一类似核酸为底物的水解酶，特别是一类能够识别和切割双链ＤＮＡ分子内特定核苷酸顺序的酶－－限制性核酸内切酶2.连接酶用于两段核酸拼接起来的酶3.聚合酶催化核酸体外合成反应的酶，包括ＤＮＡ聚合酶和ＲＮＡ聚合酶．二.植物基因转化常用酶1.核酸酶．是一类似核酸为底物的水解酶76三.植物基因转化的基本过程①从生物基因组群体中分享的基因－－从现有生物（特别是原核生物）分离出的基因②人工合成的基因ＤＮＡ片段－－将现有的ＤＮＡ片段通过化学或连接酶关系合成新的ＤＮＡ段．③ＰＣＲ反应合成ＤＮＡ④ｍＲＮＡ差异显示法获得目的基因目的基因的分离或制备三.植物基因转化的基本过程①从生物基因组群体中分77①质粒－－是一种能在细菌，放射菌和酵母细胞内寄生并独立于染色体外进行自我复制共价闭合环状ＤＮＡ（CCCDNA）,可用人工改造或天然质粒作为载体．②噬菌体－－常用的噬菌体有Ｍu噬菌体载体③粘粒－－是由质粒和Ｍu噬菌体的Ｃ05

位点u成膜等Ｍu构建而成的一种大容量克隆载体④病毒基因转化的载体及其选择①质粒－－是一种能在细菌，放射菌和酵基因转化78①粘性末端的连接－－用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同粘性末端的两种限制性内切酶分别消化外源ＤＮＡ分子和载体，所形成的ＤＮＡ末端彼此互补，用ＤＮＡ连接酶共价连接起来，形成重组分子②平末端的连接，对于平末端ＤＮＡ片段，可用末端脱氧核芽酸转化酶催化，以相应的脱氧核苷酸三磷酸为底物，在带平头末端的ＤＮＡ片段的3’-末端加上多聚核苷酸的尾巴．若载体加上多聚Ａ的尾巴，则可以和改造后的平末端ＤＮＡ连接起来．ＤＮＡ片段和载体的连接①粘性末端的连接－－用同一种限制性内切ＤＮＡ79①基因枪导入法，利用超声波使包裹ＤＮＡ溶液的重金属弹（钨，金弹）射入受体．②农杆菌导入法，利用农杆菌中存在一种致癌质粒（简称Ｔ质粒），该质粒上有一段ＤＮＡ序列可以转移到植物基因组中去．③聚乙二醇－－介导法（类似原生质融合）④电激法－－电激穿孔，再通过细胞内外的渗透压差将外源基因直接导入带壁的植物细胞内⑤显微注射法⑥花粉管通道法⑦脂质体导入法，脂质生物膜形成节状结构，即可包装重组基因，又能转入植物细胞⑧激光微系转化法－－与电激法类似目的基因的导入

①基因枪导入法，利用超声波使包裹ＤＮＡ目的基因80①Southern杂交法，利用两条单链ＤＮＡ的碱基互补性，来检测外源ＤＮＡ的转化结果②Nothern杂交法，快速，但设备要求高③Western杂交法④聚合酶链式反应（ＰＣＲ）⑤生物系鉴定，如抗病毒基因植株接种该病毒，抗除芽剂基因植株施除草剂转基因植再生及其检测①Southern杂交法，利用两条单链转基因81基因转化中的载体必须具有如下特点：①在宿主细胞中能独立自主地自我复制②容易从宿主细胞中分离纯化③载体ＤＮＡ分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插入其中的外源ＤＮＡ片断能够被动地跟着载体一起复制和扩增．基因转化中的载体必须具有如下特点：82第六节激光育种一.激光育种的意义激光（laser）是指利用受激辐射对光进行放大所发射出来的光。激光育种是以激光作为诱变因素在育种上加以应用，是诱变育种的一种。激光育种的意义在于增加育种诱变的因素（方法），提高茶树遗传变异率和丰富育种材料，增加茶树育种的可选择度，甚至有可能创造全新的品种。第六节激光育种一.激光育种的意义83二.激光诱变的机理与效果激光不同于电离辐射，它是基于物质受激辐射原理产生的一种新颖光源－－激光。激光最大的特点是光能是在空间和时间上高度集中（因此，它相干性好，导色性好）因此，它诱变的点更集中，可直接作用于染色体上，所须材料更少。激光诱变机理比较复杂，它是通过热效应，光效应，电磁场效应以及多光子吸收效应对育种材料起作用，最终使育种材料的有机体（主要使染色体上的核糖核酸）分子化，离子化并产生自由基，这些自由基又作用于核糖核酸分子，从而引起DNA分子中氢键的断裂核碱基的替换，使基因发生改变。当然也可能造成材料死亡。二.激光诱变的机理与效果84热效应：激光能使材料在很短时间和很小范围温度可达几百度至一千度，这么高的能量可改变分子结构，光，电磁效应和度光子效应都会产生电离，生成自由基。热效应：激光能使材料在很短时间和很小范围温度可达几百度至一千85三.茶树激光诱变育种的研究1.激光处理的有效波长，研究表明，波长在33710纳米的氮分子激光器对植物诱变作用较明显。2.激光诱变的材料及剂量（1）材料，辐照种子是最简便易行的，当然也可以辐照芽，花粉粒及愈伤组织。（2）剂量：剂量与波长有关，如波长为44800纳米的氩离子激光器的能量比波长为33710纳米的氮分子激光器大。剂量还与辐照时间有关，时间愈长，剂量愈大，在茶树育种中应采取多大剂量仍在探讨中。三.茶树激光诱变育种的研究863.激光诱变的选择茶树激光诱变育种应注重当代选择，若发现有利用价值的变异，可采用无性繁殖方式进行繁育，进而培育成新品种。当然还应当对F1和F2代进行，因为辐照育种诱发突变大多数隐性的，所以有些变异要在F1或F2代末表现出来。3.激光诱变的选择87第八章：分子育种第一节：基因工程与育种一、基因工程的概念应用人工方法把生物的遗传物质（通常是DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变他们的遗传特性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物，这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程就是基因工程，也称DNA重组技术。第八章：分子育种第一节：基因工程与育种88二、植物基因工程的方法和步骤（一）目的基因的分离和克隆1、基因芯片技术基因芯片是把生物活性大分子（如核酸和蛋白质）或细胞等密集排列固定在固相载体（如硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜）上，所形成的微型检测器。基因芯片技术就是利用特异性的分子间相互作用，如核酸杂交、抗原-抗体特异结合、蛋白质-蛋白质间特异结合等，将待测样本标记后与生物芯片反应，通过激光共聚莹光扫描仪等检测手段获得信号，经电脑系统处理、分析得到信号值，以次来检测样本的结构和性质。因此，可利用基因芯片技术从基因组中发现或找出某个目的基因。二、植物基因工程的方法和步骤892、基因文库技术基因文库是指汇集和克隆了某一基因组所有DNA序列的DNA群体2、基因文库技术90（二）目的基因的转化1、基因的转化的作用⑴创造新品种。⑵研究基因表达或用于基因作图和基因克隆。2、基因的转化的条件⑴有适宜的目的基因。⑵有适当的组织培养系统。能脱分化和再分化．⑶有适当的转化途径和方法。要求损失小，频率高，且外源基因能稳定地整合到基因组，并且具有正常的时空表达能力．（二）目的基因的转化913、目前植物基因转化的方法⑴农杆菌介导的基因转化法。①原理。在自然条件下，农杆菌通过伤口侵染植物，并广泛寄生于双子叶植物中。农杆菌中存在一种与肿瘤诱导有关的质粒，即Ti质粒。该质粒能够把本身的一段DNA转移至植物细胞，整合进植物基因组得以表达，并能够通过减数分裂传递给后代。可转移的DNA片段称为T-DNA。T-DNA的转移与边界序列有关，而与T-DNA区段的其他基因或序列无关，因而，可将T-DNA区段上的无关序列去掉，插入外源目的基因，当农杆菌3、目前植物基因转化的方法92侵染植物时，将目的基因转移到植物中去。②转化过程：受体系统的建立→Ti质粒转化载体的构建→目的基因的转化。③转化方法：整体植株接种共感染法；叶盘转化法；原生质体共培养转化法。⑵化学和物理诱导DNA直接转化①聚乙二醇（PEG）法。（原生质融合）②脂质体法。用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。侵染植物时，将目的基因转移到植物中去。93③电击法。④超声波法。⑤显微注射法。⑥激光微束法。⑦基因枪法。⑶种质系统介导的基因转化种质系统介导的基因转化也称生物媒体转化，即通过植物的生殖系统的细胞以及细胞结构将外源DNA转入宿主植物中去。③电击法。94①花粉管通道法。②生殖细胞浸泡法。③胚囊、子房注射法。4、基因转化方法的评价⑴农杆菌介导的基因转化法的转化频率高，周期短，可以转移大片段DNA而被广泛使用。但其受体植物只是双子叶植物。⑵化学和物理诱导DNA直接转化法不受宿主植物的限制，应用广泛，但成本较高，转化频率也不如农杆菌高。①花粉管通道法。95⑶种质系统介导的基因转化法简单易行，但成功率低。（三）转基因植株的鉴定１、转化植株的再生．目的基因的直接受体一般是细胞或组织，在鉴定目的基因被导入与否，先要诱导这些细胞或组织再分化，形成转化植株．２、转基因植株的鉴定⑴分子生物学鉴定．主要是通过分子杂交来鉴定，包括southern杂交、northern杂交、western杂交．⑵性状鉴定．即外源基因在宿主植物表达的鉴定⑶种质系统介导的基因转化法简单易行，但成功率低。96，如果是无性繁殖，外源基因表达要在下一代稳定表现，如果是有性繁殖，外源基因表达则要在后代稳定表现．三、基因工程的安全性评价（一）安全性评价的意义生物安全性评价就是要对生物技术（主要是基因工程）活动本身及其产品，可能对人类和环境的不利影响及其不确定性和风险性进行科学评估，并采取必要措施加以管理和控制，以保障人类健康和环境安全．，如果是无性繁殖，外源基因表达要在下一代稳定表现，如果是有性97（二）转基因植物安全性评价２００２年我国农业部发布了《农业转基因生物安全评价管理办法》，将农业转基因产品的生产、加工活动对转基因生物安全等级的影响分为三种类型（即：增加转基因生物的安全性；不影响转基因生物的安全性；降低转基因生物的安全性。），并根据农业转基因生物的安全等级和产品生产、加工活动对其安全等级的影响类型和影响程度，将转基因产品分为四个安全等级．（二）转基因植物安全性评价98（三）转基因植物各阶段安全性评价申报要求转基因植物生产分为五个阶段，即：立项→中间试验→环境释放→生产试验→安全证书申报．在各个阶段都要进行安全性评价申报，通过安全性评价后才能进行下一阶段的试验或生产．每次申报都要提交相关材料，如在立项阶段必须提交：实验研究报告书；农业转基因生物的安全等级和确定安全等级的依据；相应的实验室安全设施、安全管理和防范措施。在申报安全证书之前，必（三）转基因植物各阶段安全性评价申报要求99须提交：安全评价申报书；农业转基因生物的安全等级和确定安全等级的依据；农业部委托的农业转基因生物技术检测机构出具的检测报告；中间试验、环境释放和生产性试验阶段的试验总结报告；其他有关材料。须提交：安全评价申报书；农业转基因生物的安全等级和确定安全100第二节：分子标记与育种一、常用分子标记的原理和方法（一）分子标记的概念１、遗传标记。是指基因型特殊的易识别的表现形式。包括形态标记；细胞标记；生化标记和分子标记。形态标记简单直观，但数量少、多态性差、易受环境条件影响；细胞标记和生化标记经济方便，但标记数有限。2、分子标记。是指基于DNA水平多态性的遗传标记，它通过检测基因组的一批识别位点来估测基因组变异性和多样性。3、分子标记的特点第二节：分子标记与育种一、常用分子标记的原理和方法101⑴是在DNA水平上对遗传变异的直接反映，不受季节和环境的影响，也不受基因表达与否的限制。⑵多态性高。⑶大多数分子标记是共显性的，使对隐性性状的选择成为可能，鉴别出纯合基因型与杂合基因型。目前用于辅助育种的分子标记主要有限制性片段长度多态性（RＦLP）；随机扩增片段多态性（RAPD)；扩增片段多态性（AFLP)和简单重复序列（SSR).⑴是在DNA水平上对遗传变异的直接反映，不受季节和环境的影响102(二）ＲFLP标记限制性片段长度多态性（RＦLP）是用各种限制性酶将DNA分子剪切成不同大小的片段。由于突变、重组等原因，不同种属、甚至同一品种的不同个体，对同一内切酶来说，切位点和切位点之间的DNA序列都有可能不同，当用限制性内切酶处理不同生物体的DNA时，就会产生不同长度DNA片段，这就是RFLP。RFLP标记先用限制性内切酶酶解目标DNA，用电泳的方法将DNA片段分开，再通过southern印迹分析各片段的核苷酸序列及其差别．进而为生物进化、亲缘关系以及遗传育种提供依据．(二）ＲFLP标记103（二）RAPD标记随机扩增片段多态性（RAPD）是建立在DNA序列体外酶促扩增的多聚酶链式反应（PCR）的基础上的RAPD标记，其基本原理是采用人工合成的较短的随机排列碱基顺序核酸单链为引物，在一种热稳定DNA多聚酶作用下，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，获得一组不连续的DNA片段。其中每个扩增所产生的片段代表了基因组上的一个位点，所检测出来的扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。（二）RAPD标记104RAPD标记具有操作简单、引物无物种限制、多态性丰富、可采取自动化操作，提高工作效率等特点而被广泛运用。RAPD标记在育种中用于重要性状的分子标记；图谱绘制、杂种纯度鉴定等。在茶树育种方面，有人运用RAPD标记进行亲子关系鉴定；茶树遗传多样性分析；无性系突变体鉴定等。RAPD标记具有操作简单、引物无物种限制、多态性丰富、可采取105（三）AFLP标记AFLP标记是用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后对限制性片段进行选择性扩增，从而揭示DNA多态性。该技术的特点是信息量大，一次反应可检测到上百个位点，而且得到的谱带的大多数片段与基因组的单一位置相对应，故可用于遗传图谱和物理图谱的构建，此外，还可用于增加染色体特定区域的饱和性分析；回交群体遗传背景分析；种质鉴定和遗传多样性分析等等。（三）AFLP标记106（四）SSR标记(simplesequencerepeats)SSR标记是利用真核生物的基因组中普遍存在1~6个bp简单串联重复特性作为分子标记，生物个体不同，简单串联重复的核酸序列也不同，从而构成生物多样性．由于每个简单重复序列两端的碱基组成基本是相同的，因而可根据两端的序列设计一对特异引物，扩增每个位点的简单重复（微卫星）序列，进而分析生物多样性．SSR标记广泛用于连锁图谱的构建和种质资源遗传多样性的研究．（四）SSR标记(simplesequencerepea107二、分子标记在育种中的应用（一）构建遗传图谱。建立高密度分子遗传图谱，定位与目标性状紧密连锁的分子标记，有助于在茶树生育早期对群体中含有目标基因植株进行选择，从而大大提高育种效率，缩短育种周期．（二）分析亲缘关系．借助分子遗传图谱可为品种资源和鉴定和保存，研究植物的起源与进化，远缘杂交亲本的选配，预测杂种优势等提供理论依据．二、分子标记在育种中的应用108（三）分子标记辅助选择．１．在亲本选择上，传统的选择是基于田间表现型的选择，而不是对基因型的选择，但表型是基因型与环境互相作用的结果，许多性状与基因间并非一对一的线性关系．因此，依表型来推测基因型并不总是可靠的或是比较困难的，不仅需要丰富的实践经验，而且还受到许多外在条件的限制，而分子标记辅助选择则可以避免这些限制．２．可以在细胞水平和植株早期发育阶段进行鉴定，找到含有目标基因或不良性状基因的植株，早期鉴定，早期分离，早期培育，缩短育种周期．（三）分子标记辅助选择．１．在亲本选择上，传统的选择是基于田109思考题：１、将外源基因转化到植物中去的必要条件是什么？２、进行基因转化的途径有哪些？它们各有何特点？３、转基因植株的鉴定方法有哪些？４、什么是遗传标记？遗传标记包括哪些不同层次的标记方法？它们各有何特点？５、如果你已获得能抗某一主要害虫的基因，如何将该基因转化到茶树体内？试述主要步骤和方法？思考题：110６、分子标记在茶树育种中的应用有哪些？７、分子标记辅助选择在茶树早期鉴定中有何重要意义？８、常用的分子标记技术有哪些？各有哪些特点？６、分子标记在茶树育种中的应用有哪些？111单倍体育种的优越性1.控制杂种分离,缩短育种周期常规杂交育种,自花授粉植物从选择亲本开始,经杂交、分离、选择、稳定品质4~6代,加之品比、生产试验、区域试验需8~10年时间;异花授粉植物的育种周期更长,仅稳定品系就要6~7代自交.而对一些异花授粉的树木而言,这个过程更长,例如茶树至少要20年以上,正因为如此,很少有人用常规杂交育种的办法要选育有性茶树品种.如果采用单倍体育种,则能够在较短时间(3~5年)获得纯系,而选育有性茶树品种打下基础.从而缩短育种周期,杂交有性品种的可能性.单倍体育种的优越性1.控制杂种分离,缩短育种周期112茶树育种学第八章--分子育种课件1132.排出显、隐性基因干扰,提高选择效率常规育种单倍体育种亲本基因型AAbb×aaBBAAbb×aaBBF1配子基因型AaBbAaBbF2配子基因型2.排出显、隐性基因干扰,提高选择效率1142.单倍体是研究遗传变异的好材料,这点对茶树育种至关重要.由于茶树是多年生异花授粉植物,要搞清楚其遗传变异难度很大,这也制约了茶树育种技术和手段的发展.如杂交育种,转基因,抗性育种,品质育种等等.3.单倍体是诱变育种的好材料,因基因相对纯合.单倍体植株经诱变后,所以突变范围的高化发送都能在当代表现出来,而其它倍数体植株在诱变处理后,某些突变隐性基因所控制的性状变化则不能在当代表现出来,增加选择难度.2.单倍体是研究遗传变异的好材料,这点对茶树育种至关重要.由1154.克服远缘杂交不孕或不结实.主要原因是遗传差异大,染色体难以配对,利用单倍体对栽培品种进行提纯复状,对基因型混杂的品种,经单倍体加倍成纯合二倍体,再选择具有原品种优良特性特征的植物大量繁殖推广,达到提纯复状的目的.对茶树育种而言:一是缩短育种周期,二是便于资源现场研究,为育种打下基础.4.克服远缘杂交不孕或不结实.主要原因是遗传差异大,染色体难116第二节单倍体育种一、植物单倍体的概念植物在减数分裂时形成雄、雌配了,其染色体数目为体细胞的一半,将这种具有单套染色体的细胞称为单倍体细胞.单倍体细胞在人工离体条件下培养,使其单性发育成植物体,这种具有单套染色体的植物称为单倍体植物.第二节单倍体育种一、植物单倍体的概念117二、单倍体育种的概念:将具有单套染色体的单倍体植物,经人工染色体加倍,使其成为纯合二倍体.从中选育出符合人们需要的个体,直接繁育成新品种,或选出具有单一优良性状的个体,作为杂交育种的原始材料,称为单倍体育种.二、单倍体育种的概念:118花药培养的概念花药培养就是以植物花药为材料,通过组织培养形成愈伤组织,再经过诱异分体形成完整植株的过程.由于花药培养的主要目的是获得单倍体植株.因此,人们也把花药培养称为单倍体植株培养.花药培养的概念119单倍体育种的优越性(见第一节内容)单倍体育种的优越性(见第一节内容)120非均等分裂五、花粉单性发育的生物学原理及离体培养条件下小孢子发育成植物体的途径单核小孢子营养核生殖核营养细胞生殖细胞愈伤组织多细胞花粉粒单倍体植株胚状体非均等分裂五、花粉单性发育的生物学原理及离体培养条件下小孢子121六、单倍体植物的培养程序及关键技术①顺利通过消毒灭菌关②花粉发育时期的鉴定和选择用于研究遗传的可选用一些具有典型发送的品种,用于培养新品种则选择结合性较好的品种的花药.选择花药发育的单核花粉后期.③确定是否低温处理和糖处理材料准备六、单倍体植物的培养程序及关键技术122①基本培养筛选选用SJ—1和N6培养基(见P163)②植物激素种类和浓度筛选③糖浓度(渗透压)筛选接种→脱分化→愈伤组织→再分化→化苗诱导花粉脱分化分裂①基本培养筛选选用S123①花粉愈伤组织分化,植株再生(激素种类及浓度调节)取形成愈伤组织60天以上,直径在2~3mm左右且为第一代愈伤组织作再分化材料②胚状体壮苗培养:a.调节基本培养基b.降低激素和渗透压用N6培养基(见P165)分化培养和壮苗培养①花粉愈伤组织分化,植株再124①调节基本培养基,无机盐浓度下降②调节激素浓度和种类③调节糖浓度(渗透压)关键是生长素与细胞激素之比,适中则脱分化,比值高则有利于长根,比值低则有利于长芽完成植物体形成①调节基本培养基,无机125①试管菌驯化,渗透压变化和光照强度变化②移植营养土配制③保持高空气湿度(80~90%,1~2周)和低土地湿度.④用5%可湿性多菌消毒驯化与移载①试管菌驯化,126①形态鉴定②细胞学鉴定③交配鉴定④分子标记鉴定花粉植株鉴定①形态鉴1271.形态鉴定:①外形:植株瘦小,叶片窄小,花小柱头长.②结实性:开花,不结实.③花粉粒着色和大小,花粉粒败育,不着色2.细胞学鉴定.取根尖细胞镜检染色体数目1.形态鉴定:1284.分子标记鉴定:①同功酶,分析比较处理前后再生后植株的同功酶.②限制性片段长度多肽性(RFLT技术),时间长,费用高.③随机扩增多肽性(RAPD).运用单个或多个随机引物(长度为10个或多重百个核苷酸)经多聚酶链式反应,酶促扩增特异性DNA片段.从而得到多态性图谱.RAPD与PFLT比较,具操作简便,速度快,成本低,检出率高的优点.4.分子标记鉴定:129七、单倍体植物的染色体加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:①小菌浸泡法.将再生小植株从试管移出,在无菌条件下用秋水仙素溶液浸泡,再转移到新鲜的培养基去培养.②处理生长锥,醮满秋水仙素溶液的棉球置于顶芽或腋芽③培养基加倍,在培养基加入一定浓度的秋水仙素.七、单倍体植物的染色体加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:130八、茶树花药培养及展望存在的问题1.诱导效率低2.体细胞(花药、药壁、药隔)干扰问题3.目前培养基成分带有一定睛的育成性八、茶树花药培养及展望存在的问题1.诱导效率低131第三节体细胞杂交一、体细胞杂交的原理及定义体细胞杂交也称细胞融合.实质是两团来自不同亲本的原生质体的融合.原生质体是除去细胞壁的裸露细胞-------原生质体的概念.原理:已知植物细胞壁上,具有粘性很强的核酸酶.核酸酶可阻止外源DNA进入植物细胞,除去细胞壁后,可避免核酸酶对异体DNA的破坏.从而使胞质融合和转基因成为可能.第三节体细胞杂交一、体细胞杂交的原理及定义132长期以来的有性杂交方法所进行的遗传物质交换(基因重组)有如下局限性:1.同源性(自交不亲合)和异源性(杂交不亲合)限制了有性结合范围.2.由于配子形成是减数分裂的先导.而在减数分裂时,由于染色体的易位,例位、重复、缺失行为而引起染色体数目减少或增加.因为杂交后代不可能具有完整的遗传信息.而原生质体是研究遗传理论的好材料.如核质关子,杂交或自交不亲合性的机理以及激素作用机理等.长期以来的有性杂交方法所进行的遗传物质交换(基因重组)有如下1333.大多数高等植物,重组只限于染色体基因(核基因),而雄配子体细胞胞质基因不可能遗传给下一代.而体细胞杂交能克服上述局限.如扩大“杂交”范围,创造植物新物种和新品种,如固N作用,高光数,抗病虫等.有利于遗传研究.1.克服不亲合性,扩大“杂交”范围,创造新品种2.有利于研究细胞质遗传3.大多数高等植物,重组只限于染色体基因(核基因),而雄配子134二、体细胞交杂的程序①双亲原生质体制备②酶法分离原生质体.纤维素酶,果胶酶③影响原生质体活力的各种植物原生质体分离二、体细胞交杂的程序135①采用界面法纯化原生质体②筛网过滤③质膜稳定剂和渗透压稳定剂双亲原生质体混合液制备:双亲原生质体以等体积,等密度(104~105个细胞/ml)混合,制备成混合亲本原生质体.原生质体纯化①采用界面法纯136①融合法②高钙和高PH值法③聚乙二醇法④聚乙二醇和高钙,高PH值结合法.原生质体融合原生质体137

①互补选择法:白化互补,遗传