基因工程制药培训

基因工程制药简介张义浜2017-05-20概述目的基因的获得基因的表达基因工程菌的培养基因工程药物的分离纯化传统制药（生化制药）存在的问题:1.材料来源或制造技术困难而无法研制出产品；

2.从动物脏器中提取易感染病毒；

3.存在免疫原性，使用受限制。基因工程制药的优点大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽提供足够数量的生理活性物质发现更多的内源性生理活性物质利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值获得新型化合物，扩大药物筛选来源基因工程技术所生产的药物

用传统方法很难生产的，主要是药用活性蛋白质/多肽，包括：（1）免疫相关蛋白各种抗原、单克隆抗体。（2）细胞因子如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO（3）激素胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素、人松驰激素。（4）酶类尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。早期部分基因工程产品的研制、开发、上市时间产品研制国家用途上市国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人α-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素（IL）1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987美国我国批准上市的部分生物技术药物批准年份药品批准年份药品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰岛素、Anti-CD3鼠源单抗1992IFN-α2a2000人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表皮生长因子（EGF）、EGF衍生物霍乱疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源单抗凝乳剂1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液重组葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）2004重组人p53腺病毒注射液抗EGFR人源单抗1997粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）重组链激酶（γ-SK）、EPO2005重组人脑利钠肽、重组人血管内皮抑素重组人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生长激素（GH）痢疾疫苗、牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）2006重组TNFR-Fc融合蛋白

什么是基因工程技术？ 基因工程（geneticengineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的遗传物质——基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。制备基因因工程药药物的基基本过程程获得目的的基因↓↓构构建重重组质粒粒↓↓组组建基基因工程程菌(或细胞)↓↓培养工程程菌↓↓产产物分离离纯化↓↓除除菌过滤滤↓↓半半成品检检定↓↓成成品品检定↓↓包包装装上游阶段选择表达达系统主主要考虑虑：必须保证证所表达达的蛋白白质具有有生物活活性考虑基因因工程蛋蛋白质表表达量的的多少蛋白质分分离纯化化的难易易程度下游阶段基因的克隆工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目的基因因的获得得一、反转转录法二、反转转录PCR三、化学学合成法法常用的方方法:一、反转转录法为了克隆隆编码某某种特异异蛋白质质多肽的DNA序列，可可以从产产生该蛋蛋白质的真真核细胞胞中提取取mRNA,以其为模板板，在反反转录酶酶的作用用下，反转录生生成该蛋蛋白质mRNA互补DNA（cDNA第一链）），再以以cDNA第一链为为模板，，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，最最终合成成编码该该多肽的的双链DNA序列。cDNA克隆示意图DNA聚合酶ImRNA

反转录酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1二、反转转录PCR提取组织织或细胞胞中的总总RNA，以其中中的mRNA作为模板，采用用Oligo(dT)或随机引引物利用用逆转录录酶反转转录成cDNA第一链，直接接以其为为模板（不需要要合成cDNA第二链）进行PCR扩增，获得目的基因因，用于于重组、、克隆。。三、化学学合成法法前提：核核苷酸序列已知知；或已知其其蛋白质质的氨基基酸序列列，再推推导出核核苷酸序序列限制性：：1）不能直接合成太长长的基因因；2）遗传密密码的简简并性可可导致中中性突变变；3）成本较高DNA合成仪基因的克隆与与表达基因表达达：基因在生生物体中中的转录录、翻译译及所有有加工过过程。基因高效效表达：：外源基基因在某某种宿主主细胞中中的表达达活动，，即剪切切下一个个外源基基因片段段，重组组到另一一个基因因表达体体系中，，使其能能获得既既有原生生物活性性又可高高产的表表达产物物。基因表达达研究的的主要问问题：目目的基因因的表达达产量、、表达产产物的稳稳定性、、产物的的生物学学活性和和表达产产物的分分离纯化化。建立最佳佳的基因因表达体体系，是是基因表表达设计计的关键键一、宿主主菌的选选择宿主菌应应满足以以下要求求：具有高浓浓度、高高产量、、高产率率；能利用易易得廉价价原料；；不致病、、不产生生内毒素素；发热量低低，需氧氧低，适适当的发发酵温度度和细胞胞形态；；容易进行行代谢调调控；方便重组组DNA操作；产物容易易提取纯纯化。1.原核细胞胞（1）大肠杆杆菌表达产物物的形式式：细胞胞内不溶溶性表达达(包涵体)、胞内可可溶性表表达、细细胞周质质表达，，极少数数情况下下也可分分泌到细细胞外。。不同的的表达形形式具有有不同的的表达水水平及完完全不同同的杂质质。大肠杆菌菌表达外源基因因的优势势全基因组组测序，，遗传背背景清楚楚（共4405ORF）基因克隆隆表达系系统成熟熟完善繁殖迅速速、培养养简单、、操作方方便、遗遗传稳定定被美国FDA批准为安安全的基基因工程程受体生物缺陷缺乏对真真核生物物蛋白质质的复性性功能缺乏对真真核生物物蛋白质质的修饰饰加工系系统内源性蛋蛋白酶降降解空间间构象不不正确的的异源蛋蛋白细胞周质质内含有有种类繁繁多的内内毒素（2）枯草芽芽孢杆菌菌分泌能力力强，可可将蛋白白质产物物直接分分泌到培培养液中中，不形形成包涵体；不能使使蛋白质质糖基化化，另外外由于它它有很强强的胞外外蛋白酶酶，会对对产物进进行不同同程度的的降解（3）链霉菌菌重要的工工业微生生物。不不致病、、使用安安全，分分泌能力力强，可可将表达达产物直直接分泌泌到培养养液中，，具有一定定的糖基化能力2、真核细细胞（1）酵母特点：真核生物物细胞，，表达产产物能糖糖基化；；基因组小小，仅为为大肠杆杆菌的4倍；世代时间间短，繁繁殖迅速速；基因操作作与原核核生物相相似；建立了有有分泌功功能的表表达系统统，将产产物分泌泌出胞外外，分离离纯化工工艺相对对简单。。（2）丝状真真菌特点：有很强的的蛋白分分泌能力力；能正确进进行翻译译后加工工，包括括肽剪切切和糖基基化等;其糖基化化方式与与高等真真核生物物相似；；丝状真菌菌（如曲曲霉等））等被确确认是安安全菌株株，有成成熟的发发酵和后后处理工工艺。真核生物物和原核核生物基因表达达过程示意意图克隆载体:克隆了外源DNA后，转入入宿主细细胞中进进行繁殖殖，使克隆的DNA片段数量量大大增增加表达载体:将外源基因因或DNA片段在宿宿主细胞胞中表达达蛋白质质插入型型载体体:将外源源基因因或DNA插入其其中置换型型载体体:切除载体部部分DNA，代之之以外外源基基因或或DNA。载体（（vector）质粒（（plasmid）质粒是是生物物细胞胞内固固有的的、能能独立立于寄寄主细细胞染染色体体外而而自主主复制制、并并被稳稳定遗遗传的的一类类核酸酸分子子。绝大大多数数质粒是是DNA型的，，天然然DNA质粒具具有共共价、、封闭闭、环环状的的分子子结构构，即即cccDNA。基因克克隆的的载体体质粒粒DNA分子都都具有有复制制子、、选择择性标标记、、克隆隆位点点。原核细细胞表达载载体非融合合型pKK223-3分泌型型PINⅢ-ompA1融合蛋蛋白表表达载载体pGEX结构包涵体体型pBV220结构融合蛋蛋白表表达载载体非融合合型表表达载载体分泌型型表达达载体体包涵体体型表表达载载体（一））表达达载体体表达载载体必必须具具备的的条件件：载体能能够独独立的的复制制；具有灵灵活的的克隆隆位点点和方方便的的筛选选标记记,且克隆隆位点点应在在启动动子序序列后后，以以便外外源基基因表表达；；具有很很强的的启动动子，，能为为大肠肠杆菌菌的RNA聚合酶酶识别别；具有阻阻遏子子，使使启动动子受受到控控制，，只有有当诱诱导时时才能能进行行转录录；具有很很强的的终止止子，，使RNA聚合酶酶集中中力量量转录录克隆隆的外外源基基因，，而不不转录录无关关的基基因；；所产生生的mRNA必须具具有翻翻译的的起始始信号号，即即起始始密码码AUG和SD序列，，以便便转录录后能能顺利利翻译译。（二））影响响目的的基因因在大大肠杆杆菌中中表达达的因因素外源基基因的的剂量量外源基基因的的表达达效率率：A、启动动子的的强弱弱：将将目的的基因因插入入大肠肠杆菌菌RNA聚合酶酶能识识别的的强启启动子子下游游B、核糖糖体结结合位位点的的有效效性C、SD序列和和起始始密码码的间间距D、密码码子组组成：：设计计引物物或合合成基基因时时选择择大肠肠杆菌菌“偏偏爱””的密密码子子表达产产物的的稳定定性：：A、组建建融合合蛋白白；B、利用用信号号肽将将真核核基因因产物物搬至至周质质空隙隙中；；C、位点特异异性突变，，增加蛋白白的稳定性性；D、采用蛋白白酶缺陷型型大肠杆菌菌，减弱降降解作用细胞的代谢谢负荷：A、宿主细胞胞的生长与与外源基因因的表达分分开；B、宿主细胞胞的生长与与重组质粒粒的复制分分开；C、形成不溶溶性的包涵涵体工程菌的培培养条件（三）真核核基因在大大肠杆菌中中表达的形形式1.以融合蛋白白的形式表表达药物基基因其氨基端是是原核序列列，羧基端端是真核序序列，以原原核多肽和和真核蛋白白结合在一一起，称融融合蛋白。。优点：操作作简便，表表达蛋白在在菌体内稳稳定，不易易被细菌酶类降降解；易实实现高效表表达；缺点：有免免疫原性，，需切除原原核多肽2.以非融合蛋蛋白的形式式表达药物物基因非融合蛋白白指在大肠肠杆菌中表表达的蛋白白质以真核核蛋白的mRNA的AUG为起始，在在其氨基端端不含细菌菌多肽序列列。优点：保持持原有蛋白白活性；缺点：易被被蛋白酶破破坏；可能能引起人体体免疫反应应3.分泌型表达达蛋白药物物基因将外源基因因融合到编编码信号肽肽序列的下下游。常用的信号号肽有：碱碱性磷酸酶酶信号肽；；膜外周质质蛋白信号肽；霍霍乱弧菌毒毒素B亚单位；优点：在周周质中稳定定，有活性性，不含甲甲硫氨酸残残基；缺点：产量量不高，信号肽不被切割或或不在特定定位置上切切割。酵母中的基因表达达（一）表达达载体1.载体的复制制序列（1）YEp类（酵母附附加体质粒粒）（2）YRp类（酵母复复制型质粒粒）（3）YCp类（酵母着着丝粒质粒粒）（4）YIp类（酵母整合型型质粒）2.克隆载体向酵母载体体中引入大大肠杆菌质质粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，这样样构成的克克隆载体同同时带有细菌和酵酵母的复制制原点和选选择标记。。酵母常用的的选择性标标记：氨基基酸或核苷苷酸合成酶酶系基因，对对抑制酵母母生长的药药物具有抵抵抗力的抗抗性基因3.表达载体普通表达载载体：只能能方便地引引入外源基基因并进行行表达，对表达达产物的组组成，特别别是对其N末端氨基酸酸是否增减并并无严格要要求。精确表达载载体：要求求在启动子子或前导肽肽编码序列列的适当部位有有内切酶位位点，以利利于接入外外源基因，，并使它在表达达和加工后后N末端氨基酸酸序列与天天然产物相同，既无无多余的氨氨基酸，也也无缺失的的氨基酸。。（二）影响响目的基因因在酵母菌菌中表达的的因素1.外源基因的的剂量：质质粒拷贝数数及其在宿宿主细胞内内的稳定性性2.外源基因的的表达效率率：A、启动子B、分泌信号号的效率C、终止序列列的影响3.外源蛋白的的糖基化4.宿主菌株的的影响：A、菌体生长长力强；B、菌体内源源蛋白酶要要弱；C、菌株性能能稳定；D、分泌能力力强基因工程菌菌的培养基因工程菌菌发酵的基基本操作方方式有：分批培养分批培养操操作简单，，但因不能能控制生长长，获得的的菌体密度度也有限半连续培养养（补料分分批）在一次投料发发酵的基础础上，流加加一定量的的营养，使使细胞进一一步的生长，或得到更更多的代谢谢产物连续培养不断地流加加营养，并并不断地取取出发酵液液。连续培培养则多用用于动力学学特性和稳稳定性等研研究。透析培养固定化培养养基因工程菌菌培养方式式补料分批培培养补料分批培培养是将种种子接入发发酵反应器器中进行培培养，经过过一段时间间，间歇或或连续地补补加新鲜培培养基，使使菌体进一一步生长的的培养方法法。在分批培养养中，为保保持基因工工程菌生长长所需的良良好微环境境，延长其其生长对数数期，获得得高密度菌菌体，通常常把溶氧控控制和流加加补料措施施结合起来来，根据基基因工程菌菌的生长规规律来调节节补料的流流加速率。。连续培养连续培养是是将种子接接入发酵反反应器中，，搅拌培养养至菌体浓浓度达到一一定程度后后，开动进进料和出料料蠕动泵，，以一定稀稀释率进行行不间断培培养。连续培养可可以为微生生物提供恒恒定的生活活环境，控控制其比生生长速率，，为研究基基因工程菌菌的发酵动动力学、生生理生化特特性、环境境因素对基基因表达的的影响等创创造了良好好的条件。。但由于基因因工程菌的的不稳定性性，连续培培养比较困困难。为了了解决这一一问题，人人们将工程程菌的生长长阶段和基基因表达阶阶段分开，，进行两阶阶段连续培培养。在这这样的系统统中关键的的控制参数数是诱导水水平、稀释释率和细胞胞比生长速速率。优化化这三个参参数以保证证在第一阶阶段培养时时质粒稳定定，菌体进进入第二阶阶段后可获获得最高表表达水平或或最大产率率。透析培养透析培养技技术是利用用膜的半透透性原理使使培养物和和培养基分分离，其主主要目的是是通过去除除培养液中中的代谢产产物来解除除其对生产产菌的不利利影响。采用膜透析析装置是在在发酵过程程中用蠕动动泵将发酵酵液抽出打打入罐外的的膜透析器器的一侧循循环，其另另一侧通入入透析液循循环，在补补料分批培培养中，大大量乙酸在在透析器中中透过半透透膜，降低低培养基中中的乙酸浓浓度，并可可通过在透透析液中补补充养分而而维持较合合适的基质质浓度，从从而获得高高密度菌体体。膜的种类、、孔径、面面积，发酵酵液和透析析液的比例例，透析液液的组成，，循环流速速，开始透透析的时间间和透析培培养的持续续时间段都都对产物的的产率有影影响固定化培养养基因工程菌菌培养的一一大难题是是如何维持持质粒的稳稳定性。有有人将固定定化技术应应用到这一一领域，发发现基因工工程菌经固固定化后，，质粒的稳稳定性大大大提高，便便于进行连连续培养，，特别是对对分泌型菌菌更为有利利。由于这这一优点，，基因工程程菌固定化化培养研究究已得到迅迅速开展。。基因工程菌菌发酵中试试基因工程菌菌中试应考考虑的问题题：适宜商商品化生产产的工程菌菌，设计发发酵反应器器，选择反反应过程，，发酵培养养基组分，，维持生产产工艺最佳佳化的方法法，工艺监监测方法，，工艺控制制方法，工工艺自动化化使用方法法，生物催催化剂使用用，产品提提取方法的的选择，分分离精制技技术的选择择。基因工程菌菌的不稳定定性主要表现在重组组质粒的不不稳定性，，两种表现形式：：1）结构不稳定定性重组DNA分子上某一一区域发生生缺失、重重排、修饰饰，导致其其表观生物物学功能的的丧失2）分配不稳定定性整个重组DNA分子从受体体细胞中逃逸基因工程菌菌不稳定性性的可能产产生机制：受体细胞中限制修饰饰系统对外源重组组DNA分子的降解解外源基因的的高效表达达严重干扰扰受体细胞胞正常生长代代谢能量、物质的匮乏乏和外源基基因表达产产物的毒性性诱导受体体细胞产生生应激反应应：关闭合合成途径，，启动降解解程序重组质粒在在受体细胞胞分裂时的的不均匀分配重组质粒逃逸的基本原原因受体细胞中内内源性的转座座元件促进重重组分子的缺缺失重排培养基比生长速率限制性基质温度pH和溶氧外源基因表达遗传特性影响基因工程程菌稳定性的的因素载体的选择宿主的选择外源基因整合合到宿主染色色体上发酵工艺1.培养基一些基因重组组菌在复合培培养基中显示示较高的质粒粒稳定性微生物在含有有有机氮源如如酵母抽提物物、蛋白胨等等营养丰富的的复合培养基基中培养时，，由于培养基基提供了生长长必须的氨基基酸和其他物物质，微生物物的生长较基基本培养基快快。培养条件对基因工程菌稳定性的影响响2.比生长速率基因重组菌的的比生长速率率对质粒稳定定性有很大影影响。提高比比生长速率有有助于提高质质粒稳定性。。基因重组菌的的比生长速率率与培养环境境有关，如温温度，pH，溶氧，限制制性营养物质质浓度，有害害代谢产物浓浓度等。在一一定的温度和和pH下，限制性基基质浓度往往往是决定比生生长速率的主主要因素。3.限制性基质一般培养基中中各成分并不不是完全平衡衡的，经过一一段时间的培培养，微生物物的生长通常常会受到一种种或几种物质质的限制。限限制性基质的的种类对重组组菌有不同的的影响4.pH和溶解氧pH和溶氧是影响微微生物生长的的重要参数，，在发酵罐培培养基因重组组菌时，通常常都需要维持持一定的pH和溶氧水平。。在基因重组组菌的高密度度培养时，为为了维持所需需的溶氧水平平，除了提高高搅拌转速和和通气量，往往往还要在通通入的空气中中补充氧气，，以提高发酵酵罐的供氧能能力。5.外源基因的表表达外源基因的表表达会引起重重组质粒的不不稳定；尤其其当外源基因因高效表达时时，有可能因因竞争利用物物质、能量、、核糖体等干干扰宿主细胞胞的正常代谢谢活动，并造造成质粒不稳稳定。例如，吲哚丙丙烯酸（IAA）是trp操纵子阻遏物物的部分去阻阻遏剂，在培培养大肠杆菌菌MV12（pVH5）时，在培养养基中加入不不同量的IAA，发现随IAA量的增加，pVH5带有的分支酸酸合成酶和色色氨酸合成酶酶基因的表达达水平有很大大提高，同时时比生长速率率下降，培养养液中Trp－的比例上升。。电泳分析表表明60%～70%色氨酸合成能能力丧失是由由于质粒结构构的变化，其其余是由于质质粒丢失造成成。1、改进载体受体系统统以增加质粒稳定定性为目的的的构建方法包包括：1）将R1质粒上的parB基因引入表达达型载体中，，其表达产物物可以选择性性地杀死由于于分配不均匀匀所产生的无无质粒细胞2）正确确设置置载体体上的的多克克隆位位点，，禁止止DNA片段插插在稳稳定区区内3）将受受体细细胞的的致死死性基基因安安装在在载体体上，，同时时构建建条件件致死死性的的相应应受体体系统统，如如大肠肠杆菌菌的ssb基因（（DNA单链结结合蛋蛋白编编码基基因））提高基基因工工程菌菌稳定定性的的策略略2、施加加选择压压力根据载载体上上的抗抗药性性标记记，向向培养养系统统中添添加相相应的的抗生生素药物和和食品品生产产时禁禁止使使用抗抗生素素；加加入大大量的的抗生生素会会使生生产成成本增增加；；添加加一些些容易易被水水解失失活的的抗生生素，，只能能维持持一定定时间间；添添加抗抗生素素选择择压力力对质质粒结结构不不稳定定无能能为力力载体上上的营营养缺缺陷型型标记记，向向培养养系统统中添添加相相应的的营养养组份份培养基基复杂杂，成成本较较高提高基基因工工程菌菌稳定定性的的策略略3、分阶段控控制培培养因外源源基因因表达达造成成质粒粒不稳稳定时时，可可以考考虑将将发酵酵过程程分阶阶段控控制在生长长阶段段使外外源基基因处处于阻阻遏状状态，，避免免因表表达造造成不不稳定定性问问题的的发生生；在在获得得需要要的菌菌体密密度后后，再再去阻阻遏或或诱导导外源源基因因表达达。连续培培养时时可以以考虑虑采用用多级级培养养，如如在第第一级级进行行生长长，维维持菌菌体的的稳定定性，，在第第二级级进行行表达达。提高基基因工工程菌菌稳定定性的的策略略4、控制制目的基基因的的过量量表达达使用可可控型型启动动子控控制目目的基基因的的定时时表达达及表表达程程度使用可可控型型复制制子控控制质质粒的的定时时增殖殖或降降低质质粒的的拷贝贝数5、优化化基因工工程菌菌的培培养工工艺培养基基组成成：限限制培培养基基比丰丰富培培养基基更有有利于于稳定定培养温度：：较低低的培养养温度度有利利于重重组质质粒的的稳定提高基基因工工程菌菌稳定定性的的策略略6、控制制培养条条件有些含质粒粒的菌菌对发发酵环环境的的改变变比不不含质质粒的的菌反反应慢慢，因因而采采用间间隙改改变培培养条条件的的方法法以改改变这这两种种菌的的比生生长速速率，，从而而改善善质粒粒的稳稳定性性。通通过间间隙供供氧的的方法法和通通过改改变稀稀释速速率的的方法法都可可提高高质粒粒的稳稳定性性。例如研究表表达干扰素素的大肠杆杆菌W3110(pEC901)在不同同比生生长速速率下下的质质粒稳稳定性性，随随着稀稀释率率的增增加，，质粒粒稳定定性明明显增增加，，干扰扰素的的比效效价也也明显显增大大.提高基基因工工程菌菌稳定定性的的策略略7、固固定定化化培养养固定定化化可可以以提提高高基基因因重重组组大大肠肠杆杆菌菌的的稳稳定定性性基因因重重组组大大肠肠杆杆菌菌进进行行固固定定化化后后，，质质粒粒的的稳稳定定性性及及目目的的产产物物的的表表达达率率都都有有了了很很大大提提高高。。在在游游离离重重组组菌菌系系统统中中常常用用抗抗生生素素，，氨氨基基酸酸等等选选择择性性压压力力稳稳定定质质粒粒的的手手段段，，往往往往在在大大规规模模生生产产中中难难以以应应用用。。而而采采用用固固定定化化方方法法后后，，这这种种选选择择压压力力则则可可被被省省去去。。不不同同的的宿宿主主菌菌及及质质粒粒在在固固定定化化系系统统中中均均表表现现出出良良好好的的稳稳定定性性。。提高基因因工程菌菌稳定性性的策略略基因工程程药物的的分离纯纯化目的产物在初初始物料料中的含含量较低低；含目的产产物的初初始物料料组成复复杂，除除目的产产物外，，还有大大量的细细胞、代代谢物、、残留培培养基、、无机盐盐等，特特别是产产物类似似物对目目的产物物的分离离纯化影影响很大大；目的产物物的稳定定性差，，具有生生物活性性的物质质对pH、温度、、金属离离子、有有机溶剂剂、剪切切力、表表面张力力等十分分敏感，，容易失失活、变变性；种类繁多多，包括括大、中中、小分分子、结结构简单单或复杂杂的有机机化合物物，以及及结构和和性质复复杂又各各异的生生物活性性物质；；应用面广广，对其其质量、、纯度要要求高，，甚至要要求无菌菌、无热热原。基因工程程药物或或生物技技术产品品特点一、建立立分离纯纯化工艺艺需了解解的各种种因素1.含目的产产物的初初始物料料的特点点（1）菌种类型及其其代谢特特性（2）原材料料和培养养基的来来源及质质量是否否稳定（3）生产工工艺和条条件（4）初始物料的物物理、化化学和生生物学特特性2.物料中杂杂质的种种类和性性质3.目的产物物特性4.产品质量量的要求求二、分离离纯化的的基本过过程基因工程程药物的的分离纯纯化主要要分为5个步骤，，包括细胞胞破碎、、固液分分离、浓浓缩与初初步纯化化、高度度纯化直至至得到纯纯品，以以及成品品加工。。分离纯化化目的产产物主要要依赖于于色谱分分离技术术。色谱技术术分为：：离子交换换色谱亲和色谱谱凝胶过滤滤色谱高效液相相色谱等等三、重组组蛋白质的的分离纯纯化产物的主主要特性性及在分分离纯化化中的作作用基因工程程药物生生产中常常用的分分离纯化化方法基因工程程药物制制造实例例干扰素是是真核细细胞对各各种刺激激作出反反应而自自然形成成的一组组复杂的的蛋白质质。干扰扰素除具具有广谱谱抗病毒毒活性，，还具有有抑制细细胞分裂裂，特别别是抑制制肿瘤细细胞生长长和免疫疫调节等等功能，，作为一一种生物物活性蛋蛋白有着着良好的的临床应应用价值值。干扰素在在我国已已经批准准上市的的基因工工程药物物。早期获得得方法：：用病毒毒诱导人人白血球球(白细胞)产生，产产量低，，价格贵贵。300L人血才提提取1mg（一）干干扰素2003年抗非典典期间，，江南大大学与丽丽珠集团团苏州新新宝制药药厂合作作攻关，，通过发发酵工程程和生物物制药工工程研制制成功了了重组人人α-2b干扰素口口鼻腔喷喷雾剂，，解决了了干扰素素常温保保存稳定定性问题题。在疫疫区特殊殊人群捐捐赠使用用，效果果显著。。诱生的白白细胞或或者成纤纤维细胞胞提取核核酸↓通过寡dT-纤维素柱柱提取mRNApBR322质粒↓↓↓5%-23%蔗糖密度度梯度离离心提取取12S-mRNA内切酶切切割↓↓由mRNA转录成cDNA切割段位位于β内酰胺基基酶基因因内↓结结果导致致内酰胺胺基酶失失活，不不抗青霉霉素双链cDNA用末端Pst-I酶切割↓再用DNA转移酶接接上dT或者dG在pBR322质粒DNA的切割段段加上dA或者dC++++++++++++++++退火获得得杂交质质粒↓↓转转化大肠肠杆菌K-12扩增杂交交质粒↓↓筛选能够够抗四环环素、但但是对氨氨苄青霉霉素敏感感的细菌菌克隆株株↓采用杂交交翻译法法挑选含含有干扰扰素cDNA的克隆↓↓将将干扰扰素cDNA克隆进表表达载体体↓↓在在大大肠杆菌菌中进行行高效表表达↓（进入下下游工艺艺）工程菌构构建工程菌的的发酵生生产人干扰素素a-2b的基因工工程菌为为SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。

质粒粒使用PL启动子，，含有氨氨苄青霉霉素抗性性基因。。

种子子培养液液含1%蛋白胨、、0.5%酵母提取取物、0.5%NaCl。↓↓

基因因工程菌菌接种到到4个1000ml三角烧瓶瓶之中，，每个烧烧瓶内装装有250ml种子培养养基，30℃摇床培养养10小时，作作为发酵酵罐的种种子。↓↓用用15L发酵罐进进行发酵酵，装发发酵培养养基10L发酵培养养基组成成如下（（1%蛋白胨、、0.5%酵母提取取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、、50mg/ml氨苄青霉霉素、少少量防泡泡沫剂。。pH=6.8。）↓↓搅搅拌转转速500r/min、通气量量为1：1v/v*min、溶氧量量为50%30℃℃发酵8小时（细细菌增殖殖阶段））42℃诱导2-3小时（产产物生产产阶段））↓↓[监控手段段：每隔隔不同时时间，取取2毫升发酵酵液，10000r/min离心除去