江南大学微生物课件5

第六章

微生物菌种的选育江南大学生物工程学院第六章

微生物菌种的选育江南大学生物工程学院1第一节从自然界中分离筛选菌种第一节从自然界中分离筛选菌种21、生产菌株来源

索取或购买自己选育用原有菌株进行遗传改造进行育种向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选从自然界中分离菌种

从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。1、生产菌株来源3

设计方案→采样→增殖培养*→平板分离→筛选(初筛、复筛)→单株纯种分离→性能考察(生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤设计方案→采样→增殖培养*→平板分离→筛选(初筛、复4一、采样从自然界种采集含目的菌的样品1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响营养环境水分温度通风酸碱度

一、采样52 .采样方法（1） 去除表层土（2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中3. 注意记录：时间，地点，环境情况等样品袋应封好口，防止水分失去土样应在分离前破碎尽快分离2 .采样方法6二.增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制二.增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时71、增殖培养的方法

控制营养成分控制培养基pH控制培养温度

热处理——增殖芽孢细菌添加抑制剂

1、增殖培养的方法8三.纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养1.纯种分离的一般方法（1）稀释平板法倾注平板或涂布平板（2）划线法（3）组织分离法*

适用于分离高等真菌及植物病原菌三.纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯9稀释分离涂布平板稀释分离涂布平板10稀释分离倾注平板稀释分离倾注平板112、平皿反应快速检出法——定性或半定量

纸片培养显色法透明圈法变色圈法生长圈法抑制圈

2、平皿反应快速检出法——定性或半定量12琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序133、厌氧性微生物的分离法（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（2）创造无氧环境物理除氧空气置换法：干燥器或厌氧培养罐化学除氧H2+O2→H2O(钯作催化剂）GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2和CO2，H2与O2反应生成水（3）厌氧分离（培养）技术高层琼脂柱技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术3、厌氧性微生物的分离法14GasPakGasPak15厌氧手套箱厌氧培养装置厌氧手套箱厌氧培养装置16四

、筛选初筛、复筛：

四、筛选17好氧培养好氧培养18五、培养工艺条件试验与生产试验1、摇瓶发酵条件

培养基组成、初始pH、通风量（装液量）、接种量、培养温度…2、小型台式发酵罐发酵工艺条件

溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂…五、培养工艺条件试验与生产试验19第二节基因突变第二节基因突变20

突变（Mutation）定义：遗传物质核酸（DNA或病毒中的RNA）的分子结构或数量突然发生了可遗传的变化。突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变从而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它的等位基因。突变体：带有突变基因的细胞或个体突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野生型。21突变（Mutation）定义：遗传物质核酸（D一、突变类型按变化范围分突变类型(一)染色体畸变（chromosomeaberration)染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。

1、染色体数目的变化整倍体(euploidy)：含有完整的染色体组单倍体：haploid二倍体：diploid三倍体：triploid四倍体：tetraploid一、突变类型按变化范围分突变类型22非整倍体aneuploidy：含有不完整状态的染色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员的增加或减少。单体（二倍减一，monosomicdiploid):2n-1缺体（二倍减二，nullisomicdilpoid):2n-2三体（二倍加一，trisomicdiploid):2n+1四体（二倍加二，tetrasomicdiploid):2n+2双二倍加一（doubletrisomic）:2n+1+1部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍体。非整倍体aneuploidy：含有不完整状态的染色体组，一232、染色体结构的变化缺失deletion：重复duplication：倒位inversion：易位translocation：2、染色体结构的变化缺失deletion：24bfbf25(二)基因突变（genemutation）

----染色体局部座位内的变化

点突变：只涉及DNA分子中一对或少数几对碱基的改变。突变发生在一个基因范围内。多位点突变：突变超出一个基因范围。1、碱基置换basereplacementDNA链上的某一碱基对为另一碱基对所取代。转换transition：颠换transversion：(二)基因突变（genemutation）

26江南大学微生物课件527(3)遗传学效应错义突变missensemutation：同义突变silentmutation：无义突变nonsensemutation：(3)遗传学效应282、移码突变

frameshiftmutation：由于一对或少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框发生移位错误的突变。2、移码突变frameshiftmutation：由于29

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓G→AmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGCACG-3’↓C→TmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCTTTGTGCACG-3’↓C→AmutationPheAspLysProLeuStopThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGAACG-3’PheAspGluProL30

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓InsertionofAPheAspLysThrLeuValHis5’-TTCGATAAGACCCTTGTGCACG-3’

PheAspGluProL31二、按表型效应分突变类型野生型wildtype：表现该物种正常表型的生物。突变型mutant：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。形态突变型生化突变型营养缺陷型auxotrophicmutant

抗性突变型resistantmutant3.致死突变型4.条件致死突变型5.调节突变型二、按表型效应分突变类型野生型wildtype：表现该物32三、基因突变的规律不对应性或自发性、

随机性、稀有性、独立性、稳定性、可逆性、诱变性、三、基因突变的规律不对应性或自发性、331、自发突变的证实随机性、不对应性

1）波动实验2）涂布实验3）影印培养实验1、自发突变的证实随机性、不对应性

1）波动实验34波动实验波动实验35E.coliB抗噬菌体a的波动测验结果培养皿编号培养皿上菌落数样品来自同一培养物样品来自不同培养物11446411021556200031352230042148107051565500861444253031726494000816512501920564030101347764815111071012040130191400151016017170111864019002035平均值16.751.43.311.35303.8方差15273.8694662040.8E.coliB抗噬菌体a的波动测验结果培养皿编号培养皿上36四、突变的频率：突变率（mutationrate）：每个细胞每一世代中发生突变的概率。世代总数=N2-N1突变率的测定：固体平板法测突变率：m=(M2-M1)/(N2-N1)液体培养法测突变率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)液体稀释法测突变率：P0=e-mN细胞分裂非同步性效正：突变率=ln2m=0.69m四、突变的频率：37五、自发突变的机制环境因素的影响微生物自身产生的代谢物的影响转座子所造成的插入突变DNA复制过程中偶尔发生错误五、自发突变的机制环境因素的影响38六、诱变剂及其诱变机制诱变是指通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物而引起的突变。六、诱变剂及其诱变机制诱变是指通过人为的方法，利用物39(一)物理诱变剂1）辐射：uv，x-射线γ-射线等效应：点突变或染色体畸变机制：直接作用和间接作用间接作用：辐射作用于染色体外物质，产生具有诱变作用的物质；直接作用：辐射直接作用于染色体，2）热：机理复杂离子束:能量传递、动量交换，离子沉积与电荷积累过程(一)物理诱变剂1）辐射：uv，x-射线γ-射线等401、紫外线UV有效波长2650Å，紫外灯波长2537Å作用机理嘧啶二聚体、嘧啶水合物、交联作用、DNA链断裂效应：移码突变，碱基置换1、紫外线UV有效波长2650Å，紫外灯波长253741

紫外线诱发胸苷二聚体紫外线诱发胸苷二聚体422、电离辐射：x-射线，g-射线作用机理直接作用：打断化学键间接作用：通过自由基打断化学键效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变3、热作用机理：脱嘌呤效应：碱基置换，移码突变4、离子束2、电离辐射：x-射线，g-射线43(二)化学诱变剂碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入到DNA分子中的一类化合物。主要诱变剂：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；可诱发ATGC的转换。(二)化学诱变剂碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的44碱基类似物baseanalog5-溴尿嘧啶(5-BU，BU),5-氟尿嘧啶(5-FU，FU),5-氨基尿嘧啶(5-AU，AU),2-氨基嘌呤(2-AP，AP)8-氮鸟嘌呤（8-NG，NG）例：BU烯醇式：BUe，高频出现，BUe≡G酮式：BUk，低频出现，BUk=A碱基类似物baseanalog455-BU掺入后的掺入错误G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU复制错误A:T→G≡C5-BU掺入后的掺入错误G≡CG≡BUeG≡462.移码诱变剂嵌入DNA分子相邻碱基对之间，从而有利于核苷酸的环出，因此可提高移码突变的突变率。主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭(ethidiumbromide)，ICR系列化合物等2.移码诱变剂嵌入DNA分子相邻碱基对之间，从而有利于核47部分移码诱变剂

部分移码诱变剂48DNA

插入剂DNA

插入剂493.化学修饰碱基的诱变剂1）烷化剂：使DNA分子的碱基发生烷化反应，从而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂。常用的有：硫酸二乙酯(DES)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亚硝基乙基尿(NEU),亚硝基胍(NTG),乙烯亚胺(EI)等。NTG（亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制叉，可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂。3.化学修饰碱基的诱变剂1）烷化剂：使DNA分子的碱基发生烷50ChemicalreactivityofbasesisresponsibleforsomeDNAlesionChemicalreactivityofbasesi51Alkylatedbases部分烷化剂和烷化碱基alkylatingagentsAlkylatedbases部分烷化剂和烷化碱基alkyl52DNA的脱嘌呤

DNA的脱嘌呤53烷化鸟嘌呤的碱基配对

烷化鸟嘌呤的碱基配对54烷化鸟嘌呤的交联作用

烷化鸟嘌呤的交联作用55如甲基黄酸乙脂（EMS）使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和O-4-E-T分别和T、G配对，导致G∶C对转换成A∶T对；T∶A对转换成C∶G如甲基黄酸乙脂（EMS）562)

亚硝酸（introusacid,NA）有氧化脱氨作用，可使G第2个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤（xanthine,x），次黄嘌呤(H)仍和C配对，故不产生转换突变。但C和A脱氨后分别产生U和次黄嘌呤H，产生了转换，使C∶G转换成A∶T，A∶T转换成G∶C2)亚硝酸（introusacid,NA）有氧化脱氨作573)羟胺（NH2OH）只特异地和胞嘧啶起反应，在第4个C原子上加-OH，产生4-OH-C，此产物可以和A配对，使C∶G转换成T∶A作用：与C反应，造成GC→AT转换3)羟胺（NH2OH）只特异地和胞嘧啶起反应，在第4个C原58七、DNA损伤的修复1、光复活作用photoreactivation

七、DNA损伤的修复1、光复活作用photoreactiv592、切补修复excisionrepair（暗复活）2、切补修复excisionrepair（暗复活）60第三节

诱变育种第三节

诱变育种61一、诱变育种的一般步骤出发菌株↓纯化、活化、同步培养培养液↓离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液↓活菌计数，诱变预备试验诱变处理↓活细胞计数，致死率计算中间培养(后培养)↓平板分离↓变异率计算初筛→复筛→保藏及扩大试验一、诱变育种的一般步骤出发菌株62（一） 出发菌株的选择1. 出发菌株的类型2. 对诱变剂的敏感性具有特定生产性状的可能性：要尽量选择单倍体，单核细胞（孢子)（一） 出发菌株的选择1. 出发菌株的类型63（二）菌悬液的制备

细胞的生长状态2.菌悬液的均一性：3.菌悬液细胞浓度酵母、霉菌孢子：106~107个/ml细菌、放线菌孢子：108个/ml4.菌悬液介质：（二）菌悬液的制备细胞的生长状态64（三）诱变处理

1.诱变剂的选择对于低产或野生菌，uv线往往是首选，烷化剂等也是常用的诱变剂；对于经多次诱变处理的菌株，常需要强辐射进行处理。碱基置换易回复，染色体畸变、移码等不易回复细胞的透性和生理状态经常变换诱变剂或复合处理（三）诱变处理1.诱变剂的选择652.剂量选择最适剂量因诱变剂的类型、出发菌株及其生理状态的不同而不同。亚硝基胍在低死亡率剂量时突变率较高，而uv则在高致死率时才有较高的突变率。高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞处理剂量不宜过低。质量性状宜选用高剂量。经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来激活2.剂量选择663处理方法单一诱变剂处理;复合处理乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果

1-对照；2-乙烯亚胺（浓度1:7000）；3,5,7,9-紫外线；4,6,8,10-乙烯亚胺加紫外线

紫外线的剂量（erg/mm2）：3,4-2000；5,6-4000；7,8-6000；9,10-10000

3处理方法乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果1-对照；67X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变异的关系

形态突变型

负突变型

正突变型

X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变异的关68紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异的关系

紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异的关系69（四）后培养目的使突变基因纯合并表达，消除表型延迟。

后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各种生长因子。（四）后培养目的使突变基因纯合并表达，消除表型延迟。70（五）变异菌株的分离及筛选

筛选：包括初筛，复筛和终筛等。明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产量准备提高多少等；一次诱变目标不要太高制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；每一步准备采用的分析方法等。（五）变异菌株的分离及筛选筛选：包括初筛，复筛和终筛等。71诱变育种工作中应注意的问题安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如γ-射线辐射防护要求较高，uv要求较低，而化学诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触；环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。诱变育种技术要和其他育种手段相结合。诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十分大，因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工作效率。诱变育种工作中应注意的问题安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作72二

、营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型（auxotroph）突变株：是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。二

、营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型（auxotroph）73营养缺陷型突变株的用途

科研上：研究代谢途径；基因重组的遗传标记菌种；AA、碱基、维生素生物测定的试验菌种生产上：发酵法生产氨基酸，核苷酸的生产菌种；生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记营养缺陷型突变株的用途科研上：74完全培养基CompleteMedium（CM）含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。基本培养基MinimalMedium（MM）：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。补充培养基SupplementedMedium(SM)：补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。完全培养基CompleteMedium（CM）75(一)筛选方法

后培养淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型(一)筛选方法后培养761、淘汰野生型原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去方法：抗生素法：菌丝过滤法：适用于丝状真菌差别杀菌：

1、淘汰野生型原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生77抗生素淘汰野生型饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养1-2小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”；加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。注意：培养基应添加渗透压稳定剂而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质。抗生素淘汰野生型饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮782、检出缺陷型1）限量补充法2）夹层培养法3）逐个检出法4）影印培养法2、检出缺陷型1）限量补充法793、鉴定缺陷型----生长谱法大类的鉴定：营养因子：A、酪素水解液（AA混合物）B、水溶性维生素混合液C、酵母核酸水解液（碱基）D、酵母膏水溶液制备平板：缺陷型菌经CM液体培养后，离心洗涤，制成107~108个/ml菌悬液。取0.1ml涂布至MM平板上ABCD3、鉴定缺陷型----生长谱法ABCD80方法：分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的MM上，适宜温度下培养判断：A、D生长，AA缺陷型B、D生长，维生素缺陷型C、D生长，碱基缺陷型A~B、D生长，AA、维生素双缺A~C、D生长，AA、碱基双缺B~C、D生长，维生素、碱基双缺方法：分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的MM81组生长因子甲123456乙27891011丙3812131415丁4913161718戊51014171920己61115182021详细鉴定生长因子组合法组生长因子甲123456乙27891011丙3812131482营养缺陷型的生长谱鉴定营养缺陷型的生长谱鉴定83天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛HseMetThrIle二氨基庚二酸LysAKase钝齿棒杆菌L-赖氨酸生物合成途径及调节天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛HseMetThrIle二氨84不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平突变菌株突变型产量(mg/ml)钝齿棒杆菌Hse-17.93钝齿棒杆菌Thr

-2.33钝齿棒杆菌Thr

-+Met

-2.00钝齿棒杆菌AECr20.0AECr,Hse-50.0北京棒杆菌Hse-36.6Hse-,AECr45.0不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平突变菌株突变型产量(mg/85三、其它类型突变型的筛选（一）抗代谢类似物突变型的筛选抗反馈调节突变株：是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼而有之的突变株。代谢类似物：结构与代谢物类似，因此可起到代谢物所具有的调节作用的一类化合物。三、其它类型突变型的筛选（一）抗代谢类似物突变型的筛选861、抗反馈抑制突变发生基因突变的细胞：酶的结构基因发生突变导致调节酶的调节部位发生改变，不再与结构类似物（或产物）结合，从而解除了产物的反馈抑制作用，使产物得以合成。1、抗反馈抑制突变87突变前突变后抗反馈抑制突变的机制突变前882、抗反馈阻遏突变型由于调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和辅阻遏物结合，或由于操纵基因发生突变，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突变的操纵基因，从而解除产物的阻遏作用，使产物得以过量积累。2、抗反馈阻遏突变型89抗反馈阻遏突变的机制抗反馈阻遏突变的机制903、筛选方法（1）将经过诱变的细胞直接涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，长出的菌落即为抗结构类似物突变株；（2）将经过诱变的细胞涂布在基本培养基平板上，在平板的中央加少量结构类似物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗结构类似物突变株；3、筛选方法91注意：如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高注意：92结构类似物和代谢终产物终产物结构类似物过量积累产物精氨酸D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸AEC赖氨酸酪氨酸对氟苯丙氨酸,D-酪氨酸酪氨酸色氨酸5-碱基色氨酸,6-甲基色氨酸色氨酸脯氨酸3,4-二氢脯氨酸,磺胺胍脯氨酸腺苷酸2-氟腺嘌呤腺苷酸葡萄糖2-脱氧葡萄糖b-葡萄糖苷酶蔗糖,麦芽糖2-脱氧棉子糖蔗糖酶纤维二糖,葡萄糖甘油纤维素酶结构类似物和代谢终产物终产物结构类似物过量积累产物精氨酸D-93（二）组成型酶突变株的筛选1、诱导型酶在生产上的缺点诱导物往往价格昂贵受诱导物种类，浓度及分解产物的影响2、筛选原理

通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。（二）组成型酶突变株的筛选943、筛选方法

创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势或者适当的识别两类菌落的方法，从而把组成型突变株选择出来。恒化器法

以诱导物作底物，浓度低于起诱导作用浓度，诱导型菌株生长极弱，而变异株由于能产分解底物的酶，则能分解底物而得以生长，通过连续不断加入新鲜基质，使变异株数量逐渐增多，最后达到能分离的浓度。3、筛选方法95循环培养法不含诱导物培养基↔含诱导物培养基(普通碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）两菌都能生长，但组成型变异株已能合成特定的酶，亲株不能变异株调整期短，亲株调整期长，短时间培养后，变异株所占比例增大

反复循环培养几次后，变异株所占比例逐渐提高，然后进行分离循环培养法两菌都能生长，但组成型变异株已能合成特定的酶，亲96（三）细胞膜透性突变型

1、提高细胞膜透性的优点使胞内产物浓度维持较低的水平，有利于酶促反应的进行，提高产物的生成量使胞内产物浓度维持低于发生反馈抑制或阻遏的程度，以积累过量的产物2、提高细胞膜透性的措施（三）细胞膜透性突变型97第四节基因重组第四节基因重组98遗传重组的一般概念遗传重组（基因重组）：遗传重组是指遗传物质从一个细胞向另一个细胞传递并导致DNA交换和重排的过程。遗传改造的手段包括基因突变和基因重组微生物中基因重组的方式：

真核微生物：有性生殖和准性生殖；原核微生物：接合、转化、转导遗传重组的一般概念遗传重组（基因重组）：遗传重组是指遗传物质99一、细菌的转化定义：受体细胞直接吸收裸露的外源DNA并与其自身遗传物质发生重组，从而使受体细胞获得共体细胞部分遗传性状的现象。1、转化过程感受态受体细胞转化因子的吸附和吸收转化因子的整合及转化子的形成一、细菌的转化定义：受体细胞直接吸收裸露的外源DNA并与其自100转化过程转化过程101转化因子的整合转化因子的整合102二、转导Transduction

通过噬菌体作为媒介，而把一个细菌的基因导入另一个细菌的过程叫转导。转导的组分：供体细菌，受体细菌，转导噬菌体二、转导Transduction103（一）局限性转导specializedtransduction

只能传递供体染色体上原噬菌体整合位点附近的少数固定基因的转导。1、转导噬菌体的形成

Campbell模型（不正确切离）形成频率：10-6

（一）局限性转导specializedtransducti104江南大学微生物课件51052、转导子的形成稳定转导子的获得——双交换不稳定转导子的获得——溶原化

2、转导子的形成106江南大学微生物课件5107江南大学微生物课件5108（二）普遍性转导

generalizedtransduction能传递供体的任何基因的转导。1、转导噬菌体的形成选择性包裹模型形成频率：10-6（二）普遍性转导

generalizedtransduc109江南大学微生物课件51102、转导子的形成完全转导与完全转导子Completetransduction通过双交换而实现约占1/102、转导子的形成111流产转导与流产转导子

Abortivetransduction进入受体的供体DNA片段既不复制，也不整合，但能正常表达。流产转导与流产转导子

Abortivetransduc1123、共转导cotransduction由一个转导噬菌体同时传递两个供体基因的转导。共转导的频率3、共转导cotransduction113普遍性转导与局限性转导的区别普遍性转导局限性转导能转导的基因供体的任何基因特定基因,l:gal,bio噬菌体在供体菌中的位置无特定的位置有特定的位置gal-l-bio转导噬菌体的获得自发裂解或诱导裂解诱导裂解转导子非溶源性1/10稳定的完全转导子9/10不稳定流产转导子缺陷溶源性1/3稳定转导子2/3不稳定转导子普遍性转导与局限性转导的区别普遍性转导局限性转导能转导的114三、细菌的接合供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程。Conjugationisthemechanismbywhichgeneticmaterialistransferredbetweentwocellsbyplasmids.三、细菌的接合供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞115江南大学微生物课件5116江南大学微生物课件51171、F-、F+、Hfr菌株F+菌株Hfr菌株F-菌株F+Hfr1、F-、F+、Hfr菌株F+Hfr1182、细菌接合作用（1）F+×F-结果：F-转变为F+2、细菌接合作用119（2）Hfr×F-

HfrDNA的转移（2）Hfr×F-

HfrDNA的转移120江南大学微生物课件5121形成部分杂合子形成部分杂合子122通过双交换形成重组体形成lac+ade+重组体形成lac-ade+重组体通过双交换形成重组体形成lac+ade+重组体形成lac-a123相同点

含有F因子，都具有性纤毛，都具有接合作用不同点Hfr细菌F+

对于吖啶橙处理稳定F因子易失去传递供体染色体基因高频(10-3~10-4)低频(10-6~10-7)F因子本身转移基本不能频率70%以上F因子复制随细菌染色体复制独立复制F+与Hfr菌株的异同点相同点含有F因子，都具有性纤毛，都具有接合作用1243、F因子转导

F’因子：带有细菌基因的F因子。例F-lac，F-gal，F-pro…F’因子的形成：Hfr菌株中F因子的异常切除（aberrantexcision)F因子转导（性因子转导、性导）通过F’因子的转移而使受体细菌改变其遗传性状的现象3、F因子转导

F’因子：带有细菌基因的F因子。125江南大学微生物课件5126四、真菌的有性生殖Sexualreproduction一、真菌有性生殖过程二、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)的生活史四、真菌的有性生殖Sexualreproduction127江南大学微生物课件5128五、真菌的准性生殖Parasexualreproduction能进行准性生殖的微生物：Aspergillusnidulans;Asp.niger;Asp.sojaePenicilliumchrysogenum;Fusariumoxysporum（一）准性生殖的过程异核体形成；（杂合）二倍体形成；体细胞交换和单元化五、真菌的准性生殖Parasexualreproduct1291、异核体的形成异核体细胞：并存有两个不同遗传性状的核的细胞异核体菌丝体：由异核体细胞构成的菌丝体异核体的无性繁殖：产生亲代类型的单倍体分生孢子异核体的生物学意义：具有生长优势；可以储备隐性突变1、异核体的形成1302、异核体的形成(1)选择亲本A.亲缘关系近B.生活力、产生分生孢子的能力及数量相似C.带不同的遗传标记(2)创造形成异核体的条件A.限制性培养基B.孢子混合数量：106~1082、异核体的形成131（二）杂合二倍体的形成1、形成：将106~107个异核体的分生孢子涂至MM上，长出的少数菌落即为二倍体2、检出：避免异核体分生孢子重新形成异核体的措施MM要十分纯正采用具有分生孢子颜色突变型和营养缺陷型作遗传标记（二）杂合二倍体的形成132（三）有丝分裂分离二倍体在有丝分裂过程中发生基因重组，使隐性基因得以表达，由此产生各种类型的分离子。1、体细胞交换与体细胞重组体（1）体细胞交换：在有丝分裂过程中同源染色体发生的交换。由此导致部分基因的纯合化。（三）有丝分裂分离133江南大学微生物课件51342、单元化过程与非整倍体及单倍体分离子单元化过程：是在一系列有丝分裂过程中发生的染色体不离开行为的结果。

2、单元化过程与非整倍体及单倍体分离子135有性生殖与准性生殖的区别有性生殖准性生殖导致有性孢子的产生，其形态、生理均与营养体细胞不同，往往产生在特殊的囊器中导致重组体细胞产生，其和一般营养体细胞相同，不产生在特殊的囊器中减数分裂导致基因重组，减数分裂中染色体交换和减半是有规律的协调过程，是必然的有丝分裂导致基因重组，有丝分裂中，染色体交换和减少是不规则且不协调的过程，是偶然的有性生殖与准性生殖的区别有性生殖准性生殖导致有性孢子的产136六、原生质体融合技术1、原生质体融合育种的优势：基因重组频率提高重组的亲本范围扩大融合子集中两亲本优良性状的机会增大

六、原生质体融合技术1、原生质体融合育种的优势：137（一）原生质体融合技术的一般步骤融合亲本的选择与标记；原生质体的制备；原生质体的融合；原生质体的再生；融合子的选择与鉴定；目标菌株的筛选。（一）原生质体融合技术的一般步骤融合亲本的选择与标记；138七、基因工程育种Geneticengineering重组DNA技术：recombinantDNAtechnology

基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。七、基因工程育种Geneticengineering139目的基因(DNA)载体DNA重组DNA受体细胞具表达目的基因功能的重组菌DNA连接酶转化、转导或转染筛选（利用遗传标记或分子生物学方法等）

基因工程操作的主要过程目的基因(DNA)载体DNA重组DNA受体细胞具表达目的基因140一、目的基因的获得主要方法化学合成

PCR扩增从DNA文库中筛选一、目的基因的获得1411、PCR体外扩增目的基因PolymeraseChainReaction——聚合酶链式反应一种体外DNA扩增技术，用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段(靶序列）在DNA聚合酶催化下，通过两条人工合成的单链引物的引导而扩增模板DNA片段的方法1、PCR体外扩增目的基因142(1)基本PCR组成：含目标DNA序列的模板DNA(Template)寡核苷酸引物(Primers)：界定复制范围两端的引物DNA聚合酶：(Taq.Polymearse)DNA合成底物及水：dNTPs(1)基本PCR组成：143(2)PCR反应——三个主要步骤变性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：50~65℃延伸(extension)：72℃20~30个循环(2)PCR反应——三个主要步骤144江南大学微生物课件5145江南大学微生物课件51462.基因文库法（1）从共体菌基因组DNA获取目的基因DNA文库：

生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。分离染色体DNA用限制性酶部分水解分离选出一定大小合适克隆的DNA片段2.基因文库法147基因文库构建步骤提取DNA酶解电泳分离与载体连接导入宿主筛选阳性克隆基因文库构建步骤148二、优良载体的选择优良载体应具备的特点对E.coli受体细胞，载体有质粒载体、λ噬菌体载体、柯斯质粒载体三、目的基因与载体DNA的体外重组粘性末端连接平齐末端连接二、优良载体的选择149四.重组载体导入宿主细胞转化或转染体外包装与感染电穿孔法electroporation四.重组载体导入宿主细胞150五、重组受体细胞的筛选和鉴定遗传学方法：检测选择性标记免疫化学方法：检测目的基因产物核酸杂交方法：检测目的基因直接检出法：检测基因产物五、重组受体细胞的筛选和鉴定遗传学方法：检测选择性标记151外源基因插入tet钝化tetr受体细胞是Amp、Tetd的敏感型在Amp+Tet培养基上生长的是野生型质粒在Amp培养基上生长的带有重组质粒选择性标记筛选例一外源基因插入tet选择性标记筛选例一152例二、b-半乳糖苷酶显色反应（蓝白斑试验）检出携带外源DNA的载体

b-半乳糖苷酶以四聚体形式存在能将无色底物X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)切割成半乳糖和深蓝色的5-bromo-4-chloroindigo，菌落呈蓝色宿主lacZDM15基因合成的是缺失N-末端11~41氨基酸的缺陷型酶，无活性pUC18等质粒具有lacZ’基因，所编码酶的N-末端片段与lacZDM15产物组成有活性的酶pUC18上在lacZ’中间具有MCS，外源DNA片段的插入，使lacZ’无完整产物，不能与lacZDM15产物组成有活性的酶，菌落呈无色例二、b-半乳糖苷酶显色反应（蓝白斑试验）153八、基因定位诱变定位突变site-specificmutagensis

用合成的DNA和重组DNA技术在基因精确限定的残基上引入突变。包括删除、插入和置换特定的碱基序列。八、基因定位诱变定位突变site-specificm154第六节菌种退化、复壮与保藏

第六节菌种退化、复壮与保藏155一.菌种的退化菌种退化degeneration的表现

生产性状的劣化,遗传标记的丢失,原有的典型性状的不典型等菌落及细胞形态的改变生长速度缓慢代谢产物生产能力下降，即负突变致病菌对宿主侵染力下降抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱一.菌种的退化菌种退化degeneration的表现1562.菌种退化的原因：基因自发突变退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。自发突变率10-8~10-9

加速退化的因素传代次数过多不适宜的培养条件2.菌种退化的原因：基因自发突变1573.防止退化的措施控制传代次数创造良好的培养条件利用不易衰退的细胞传代采用有效的菌种保藏方法

3.防止退化的措施158二.菌种的复壮rejuvenation

狭义复壮

在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；广义复壮

在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种二.菌种的复壮rejuvenation狭义复壮广义复壮159三.菌种的保藏（一）目的

使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用。（二）原理

挑选典型培养物（typicalculture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。三.菌种的保藏（一）目的160（二）常用的菌种保藏方法1、斜面保藏法方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏措施：低温：4℃适用：各大类保藏期：1~6个月用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间2、石蜡油封藏法方法：斜面或半固体接种→培养→加无菌液蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏措施：低温，隔氧适用：不能利用石油的各大类保藏期：1~2年优点：简便（二）常用的菌种保藏方法1613、砂土管保藏法

方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：无营养，缺氧，干燥适用：产孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年4、冷冻干燥保藏

方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→检查真空度→保藏措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂适用：各大类保藏期：5~15年或更长3、砂土管保藏法1625、甘油悬液低温冷冻保藏法

方法：菌种培养→15~30%甘油缓冲液悬浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油）适用：细菌、酵母菌保藏期：约10年6、液氮保藏法方法：菌种培养→保护剂悬浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低温（-196℃）、保护剂适用：各大类保藏期：>15年

5、甘油悬液低温冷冻保藏法163第六章

微生物菌种的选育江南大学生物工程学院第六章

微生物菌种的选育江南大学生物工程学院164第一节从自然界中分离筛选菌种第一节从自然界中分离筛选菌种1651、生产菌株来源

索取或购买自己选育用原有菌株进行遗传改造进行育种向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选从自然界中分离菌种

从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。1、生产菌株来源166

设计方案→采样→增殖培养*→平板分离→筛选(初筛、复筛)→单株纯种分离→性能考察(生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤设计方案→采样→增殖培养*→平板分离→筛选(初筛、复167一、采样从自然界种采集含目的菌的样品1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响营养环境水分温度通风酸碱度

一、采样1682 .采样方法（1） 去除表层土（2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中3. 注意记录：时间，地点，环境情况等样品袋应封好口，防止水分失去土样应在分离前破碎尽快分离2 .采样方法169二.增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制二.增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时1701、增殖培养的方法

控制营养成分控制培养基pH控制培养温度

热处理——增殖芽孢细菌添加抑制剂

1、增殖培养的方法171三.纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养1.纯种分离的一般方法（1）稀释平板法倾注平板或涂布平板（2）划线法（3）组织分离法*

适用于分离高等真菌及植物病原菌三.纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯172稀释分离涂布平板稀释分离涂布平板173稀释分离倾注平板稀释分离倾注平板1742、平皿反应快速检出法——定性或半定量

纸片培养显色法透明圈法变色圈法生长圈法抑制圈

2、平皿反应快速检出法——定性或半定量175琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序1763、厌氧性微生物的分离法（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（2）创造无氧环境物理除氧空气置换法：干燥器或厌氧培养罐化学除氧H2+O2→H2O(钯作催化剂）GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2和CO2，H2与O2反应生成水（3）厌氧分离（培养）技术高层琼脂柱技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术3、厌氧性微生物的分离法177GasPakGasPak178厌氧手套箱厌氧培养装置厌氧手套箱厌氧培养装置179四

、筛选初筛、复筛：

四、筛选180好氧培养好氧培养181五、培养工艺条件试验与生产试验1、摇瓶发酵条件

培养基组成、初始pH、通风量（装液量）、接种量、培养温度…2、小型台式发酵罐发酵工艺条件

溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂…五、培养工艺条件试验与生产试验182第二节基因突变第二节基因突变183

突变（Mutation）定义：遗传物质核酸（DNA或病毒中的RNA）的分子结构或数量突然发生了可遗传的变化。突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变从而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它的等位基因。突变体：带有突变基因的细胞或个体突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野生型。184突变（Mutation）定义：遗传物质核酸（D一、突变类型按变化范围分突变类型(一)染色体畸变（chromosomeaberration)染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。

1、染色体数目的变化整倍体(euploidy)：含有完整的染色体组单倍体：haploid二倍体：diploid三倍体：triploid四倍体：tetraploid一、突变类型按变化范围分突变类型185非整倍体aneuploidy：含有不完整状态的染色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员的增加或减少。单体（二倍减一，monosomicdiploid):2n-1缺体（二倍减二，nullisomicdilpoid):2n-2三体（二倍加一，trisomicdiploid):2n+1四体（二倍加二，tetrasomicdiploid):2n+2双二倍加一（doubletrisomic）:2n+1+1部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍体。非整倍体aneuploidy：含有不完整状态的染色体组，一1862、染色体结构的变化缺失deletion：重复duplication：倒位inversion：易位translocation：2、染色体结构的变化缺失deletion：187bfbf188(二)基因突变（genemutation）

----染色体局部座位内的变化

点突变：只涉及DNA分子中一对或少数几对碱基的改变。突变发生在一个基因范围内。多位点突变：突变超出一个基因范围。1、碱基置换basereplacementDNA链上的某一碱基对为另一碱基对所取代。转换transition：颠换transversion：(二)基因突变（genemutation）

189江南大学微生物课件5190(3)遗传学效应错义突变missensemutation：同义突变silentmutation：无义突变nonsensemutation：(3)遗传学效应1912、移码突变

frameshiftmutation：由于一对或少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框发生移位错误的突变。2、移码突变frameshiftmutation：由于192

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓G→AmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGCACG-3’↓C→TmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCTTTGTGCACG-3’↓C→AmutationPheAspLysProLeuStopThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGAACG-3’PheAspGluProL193

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓InsertionofAPheAspLysThrLeuValHis5’-TTCGATAAGACCCTTGTGCACG-3’

PheAspGluProL194二、按表型效应分突变类型野生型wildtype：表现该物种正常表型的生物。突变型mutant：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。形态突变型生化突变型营养缺陷型auxotrophicmutant

抗性突变型resistantmutant3.致死突变型4.条件致死突变型5.调节突变型二、按表型效应分突变类型野生型wildtype：表现该物195三、基因突变的规律不对应性或自发性、

随机性、稀有性、独立性、稳定性、可逆性、诱变性、三、基因突变的规律不对应性或自发性、1961、自发突变的证实随机性、不对应性

1）波动实验2）涂布实验3）影印培养实验1、自发突变的证实随机性、不对应性

1）波动实验197波动实验波动实验198E.coliB抗噬菌体a的波动测验结果培养皿编号培养皿上菌落数样品来自同一培养物样品来自不同培养物11446411021556200031352230042148107051565500861444253031726494000816512501920564030101347764815111071012040130191400151016017170111864019002035平均值16.751.43.311.35303.8方差15273.8694662040.8E.coliB抗噬菌体a的波动测验结果培养皿编号培养皿上199四、突变的频率：突变率（mutationrate）：每个细胞每一世代中发生突变的概率。世代总数=N2-N1突变率的测定：固体平板法测突变率：m=(M2-M1)/(N2-N1)液体培养法测突变率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)液体稀释法测突变率：P0=e-mN细胞分裂非同步性效正：突变率=ln2m=0.69m四、突变的频率：200五、自发突变的机制环境因素的影响微生物自身产生的代谢物的影响转座子所造成的插入突变DNA复制过程中偶尔发生错误五、自发突变的机制环境因素的影响201六、诱变剂及其诱变机制诱变是指通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物而引起的突变。六、诱变剂及其诱变机制诱变是指通过人为的方法，利用物202(一)物理诱变剂1）辐射：uv，x-射线γ-射线等效应：点突变或染色体畸变机制：直接作用和间接作用间接作用：辐射作用于染色体外物质，产生具有诱变作用的物质；直接作用：辐射直接作用于染色体，2）热：机理复杂离子束:能量传递、动量交换，离子沉积与电荷积累过程(一)物理诱变剂1）辐射：uv，x-射线γ-射线等2031、紫外线UV有效波长2650Å，紫外灯波长2537Å作用机理嘧啶二聚体、嘧啶水合物、交联作用、DNA链断裂效应：移码突变，碱基置换1、紫外线UV有效波长2650Å，紫外灯波长2537204

紫外线诱发胸苷二聚体紫外线诱发胸苷二聚体2052、电离辐射：x-射线，g-射线作用机理直接作用：打断化学键间接作用：通过自由基打断化学键效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变3、热作用机理：脱嘌呤效应：碱基置换，移码突变4、离子束2、电离辐射：x-射线，g-射线206(二)化学诱变剂碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入到DNA分子中的一类化合物。主要诱变剂：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；可诱发ATGC的转换。(二)化学诱变剂碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的207碱基类似物baseanalog5-溴尿嘧啶(5-BU，BU),5-氟尿嘧啶(5-FU，FU),5-氨基尿嘧啶(5-AU，AU),2-氨基嘌呤(2-AP，AP)8-氮鸟嘌呤（8-NG，NG）例：BU烯醇式：BUe，高频出现，BUe≡G酮式：BUk，低频出现，BUk=A碱基类似物baseanalog2085-BU掺入后的掺入错误G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU复制错误A:T→G≡C5-BU掺入后的掺入错误G≡CG≡BUeG≡2092.移码诱变剂嵌入DNA分子相邻碱基对之间，从而有利于核苷酸的环出，因此可提高移码突变的突变率。主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭(ethidiumbromide)，ICR系列化合物等2.移码诱变剂嵌入DNA分子相邻碱基对之间，从而有利于核210部分移码诱变剂

部分移码诱变剂211DNA

插入剂DNA

插入剂2123.化学修饰碱基的诱变剂1）烷化剂：使DNA分子的碱基发生烷化反应，从而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂。常用的有：硫酸二乙酯(DES)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亚硝基乙基尿(NEU),亚硝基胍(NTG),乙烯亚胺(EI)等。NTG（亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制叉，可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂。3.化学修饰碱基的诱变剂1）烷化剂：使DNA分子的碱基发生烷213ChemicalreactivityofbasesisresponsibleforsomeDNAlesionChemicalreactivityofbasesi214Alkylatedbases部分烷化剂和烷化碱基alkylatingagentsAlkylatedbases部分烷化剂和烷化碱基alkyl215DNA的脱嘌呤

DNA的脱嘌呤216烷化鸟嘌呤的碱基配对

烷化鸟嘌呤的碱基配对217烷化鸟嘌呤的交联作用

烷化鸟嘌呤的交联作用218如甲基黄酸乙脂（EMS）使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和O-4-E-T分别和T、G配对，导致G∶C对转换成A∶T对；T∶A对转换成C∶G如甲基黄酸乙脂（EMS）2192)

亚硝酸（introusacid,NA）有氧化脱氨作用，可使G第2个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤（xanthine,x），次黄嘌呤(H)仍和C配对，故不产生转换突变。但C和A脱氨后分别产生U和次黄嘌呤H，产生了转换，使C∶G转换成A∶T，A∶T转换成G∶C2)亚硝酸（introusacid,NA）有氧化脱氨作2203)羟胺（NH2OH）只特异地和胞嘧啶起反应，在第4个C原子上加-OH，产生4-OH-C，此产物可以和A配对，使C∶G转换成T∶A作用：与C反应，造成GC→AT转换3)羟胺（NH2OH）只特异地和胞嘧啶起反应，在第4个C原221七、DNA损伤的修复1、光复活作用photoreactivation

七、DNA损伤的修复1、光复活作用photoreactiv2222、切补修复excisionrepair（暗复活）2、切补修复excisionrepair（暗复活）223第三节

诱变育种第三节

诱变育种224一、诱变育种的一般步骤出发菌株↓纯化、活化、同步培养培养液↓离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液↓活菌计数，诱变预备试验诱变处理↓活细胞计数，致死率计算中间培养(后培养)↓平板分离↓变异率计算初筛→复筛→保藏及扩大试验一、诱变育种的一般步骤出发菌株225（一） 出发菌株的选择1. 出发菌株的类型2. 对诱变剂的敏感性具有特定生产性状的可能性：要尽量选择单倍体，单核细胞（孢子)（一） 出发菌株的选择1. 出发菌株的类型226（二）菌悬液的制备

细胞的生长状态2.菌悬液的均一性：3.菌悬液细胞浓度酵母、霉菌孢子：106~107个/ml细菌、放线菌孢子：108个/ml4.菌悬液介质：（二）菌悬液的制备细胞的生长状态227（三）诱变处理

1.诱变剂的选择对于低产或野生菌，uv线往往是首选，烷化剂等也是常用的诱变剂