实验8紫外线对枯草杆菌的诱变效应课件

实验八紫外线、化学诱变剂对枯草杆菌的诱变效应实验目的：了解紫外线诱变原理，初步掌握紫外线诱变育种的方法。实验用紫外线对产淀粉酶的枯草芽孢杆菌进行诱变处理。根据枯草杆菌在淀粉培养基上透明圈直径的大小来指示诱变效应。相同条件下，透明圈越大表示淀粉酶活性越强。（一）紫外线对枯草杆菌的诱变作用实验原理紫外线诱变的主要作用是使细菌DNA链中相邻二个嘧啶核苷酸形成二聚体，并阻碍双链的解开和复制，从而引起基因突变，最终导致表型的变化。受紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理过的微生物样品需用黑纸或黑布包裹以避免可见光的照射。另外，照射处理后的孢子液不要储放太久，以免突变在黑暗中修复。

实验步骤

1.菌液的制备：把枯草杆菌菌种接入有100ml培养基的250ml无菌三角瓶中，37℃振荡培养14-18h。2.稀释：取摇瓶培养至对数期的菌液（菌液浓度为108-1010）0.5ml入4.5ml生理盐水中，进行10倍稀释，稀释度为10–1-10–8。3.涂布：取10–1-10–8的菌液各100ul涂平板，每个稀释度涂平板2只。4.紫外线处理：（1）在暗室或红光下进行紫外线处理。预先打开紫外灯照射15min,使光波稳定。（2）紫外线处理：10–5和10–6照射45S，10–3和10-4照射90S，10–1和10–2照射180S。以10–7和10-8平板作对照。处理后的平皿用黑纸包好，置37℃培养，48h后观察并记录结果。紫外灯功率为30W，照射距离为30cm

（3）观察诱变效应：取出平皿，分别向菌落分散开的平板内加卢戈氏碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈，分别测量透明圈与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，把明显大于对照的菌落接到斜面培养保存。（4）计算存活率及致死率：存活率=处理后每毫升活菌数/对照每毫升活菌数X100%致死率（%）=1-存活率2.为保证诱变效果，在照射中和照射后的操作应注意那些问题？1.紫外线诱变作用的机理是什么？结果与讨论化学诱变剂可引起微生物DNA链碱基排列的改变或是结构的改变，导致了编码氨基酸的变化，而影响某些蛋白质的合成或酶的活性，使生物的某一性状发生改变。此改变可稳定地遗传给后代，形成具有新的遗传性状的菌株。实验原理常用的化学诱变剂有：硫酸二乙酯，盐酸氮芥，亚硝酸钠，乙酸亚胺和亚硝基胍等。1.枯草杆菌对数期培养液的制备：将1环已活化的枯草杆菌接种到50ml肉汤蛋白胨液体培养基中，30℃振荡培养16h。2.菌悬液的制备：取5ml已培养至对数期的菌液于试管中,3000r/min离心15min,弃上清，菌体用0.1mol/LpH7.0的磷酸缓冲液洗涤2次后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。实验步骤

分别取10–3，10–4，10–53个稀释度的菌液各0.1ml，放入淀粉平板培养基中，用涂棒涂匀，每个稀释度按处理时间重复两个平板，涂布后置37℃培养24-48h。4.涂平板：对照：以同样操作取未经硫酸二乙酯处理的菌液稀释涂平板（10–3，10–4，10–5各涂2块板）注意：硫酸二乙酯有毒，不能接触皮肤，操作时可戴上一次性乳胶手套。5.计数：将培养24-48h后的平板取出进行细胞计数，并计算出诱变处理15min和30min后的存活率。6.观察诱变效应：分别向菌落分散开的平板内滴加碘液数滴，菌落周围将出现透明圈，分别量5组透明圈的直径和菌落的直径，并计算其比值，与对照进行比较，说明诱变效应。将透明圈大的菌落移接到斜面培养基上培养，做复筛用。结果与讨论

1.将实验数据列表表示