分子诊断-4 .病毒基因组

第四章病毒基因组

Viralgenome

MajorObjectives掌握：病毒的概念、病毒基因组的核酸类型和分类。病毒基因组的一般结构特点。RNA逆转录病毒基因组的结构特点。熟悉：DNA病毒基因组、RNA病毒基因组的结构特点。了解：类病毒、拟病毒和朊病毒的概念。重点：病毒基因组的一般结构特点。难点：

HBV、流感病毒、艾滋病毒基因组的主要结构特征。

BriefContents第一节病毒基因组的一般特征第二节DNA病毒基因组第三节RNA病毒基因组第四节逆转录病毒基因组比较原始的、有生命特征的能够自我复制的严格细胞内寄生的非细胞生物是结构最简单、最微小的生命形式病毒（virus）的概念病毒的四种基本结构成份①病毒基因组②衣壳③包膜④其它内容物：酶、核酸结合蛋白及金属离子等。

第一节病毒基因组的一般特征一、病毒基因组的组成和分类双链RNA单链RNA：正链：序列与mRNA相同

负链：序列与mRNA互补DNARNA

双链DNA：HBV

单链DNA：M13噬菌体病毒基因组核酸的类型一个核酸分子;数个核酸分子（分段基因组）线状和环状分子病毒分类:根据基因组组成及复制方式

DNA病毒（DNAViruses）第一组：双链DNA病毒（dsDNAViruses）第二组：单链DNA病毒（ssDNAViruses）

RNA病毒（RNAvirus）第三组：双链RNA病毒（dsRNAViruses）第四组：正链RNA病毒（(+)ssRNAViruses）第五组：负链RNA病毒（(-)ssRNAViruses）

DNA与RNA逆转录病毒第六组：RNA逆转录病毒

（RNAReverseTranscribingViruses）第七组：DNA逆转录病毒

（DNAReverseTranscribingViruses）亚病毒因子（SubviralAgents）卫星（Satellites）类病毒（Viroids）朊病毒（Prions）卫星病毒：一类基因组缺损、需要依赖辅助病毒，基因才能复制和表达，才能完成增殖的亚病毒。类病毒：目前已知最小的可传染的致病因子，比普通病毒简单。类病毒是无蛋白质外壳保护的游离的共价闭合环状单链RNA分子，侵入宿主细胞后自我复制，并使宿主致病或死亡。朊病毒：可以引起同种或异种蛋白质构象改变而致病或功能改变的蛋白质。最常见的是引起传染性海绵样脑病(疯牛病)的蛋白质。正常prion异常prion（二级结构及其它变化）正常动物PrPc

（二级结构多为α螺旋、对蛋白酶敏感、水溶性好）致病蛋白PrPsc（一级结构相同，但二级结构全为β折叠，抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉样沉淀）未知蛋白脑组织中的淀粉样蛋白斑疯牛病的脑组织切片（空泡）二、病毒基因组的大小基因组大小：1.5×103

～3.6×106bp（nt）编码基因：5~数百个最大基因组：痘苗病毒科，dsDNA病毒，～3.6×106bp，编码数百个蛋白质；乙型肝炎病毒：仅3.2Kb，编码6个蛋白质

核酸的性质：DNA或RNA核酸链的数量及大小链末端的结构核苷酸序列编码能力（编码的蛋白质数）调控元件（增强子、启动子和终止子）病毒基因组的要素：三、病毒基因组的结构特点

（一）帽子和poly（A）尾结构与真核mRNA5′帽和3′poly(A)尾相似作用：对RNA有保护作用参与蛋白质的翻译过程与病毒的感染性有关常见于：大多数真核病毒的正链RNA基因组双链RNA基因组的正链RNA病毒mRNA（二）末端重复序列结构

是指病毒基因组双链DNA分子两端具有能够互补的单链DNA部分。作用：形成环状结构或连接成二联体或多联体。1.粘性末端图4-1带粘性末端的病毒双链DNA基因组形成环状结构或二聚体环化聚合2.末端正向重复序列又称末端冗余（terminalredundancy）；是指双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸序列；疱疹病毒、T4及T7噬菌体基因组；经外切核酸酶切割产生粘性末端，也可使病毒基因组环化或形成多联体。3.末端反向重复序列

是指病毒基因组两端的反向互补重复序列。单链DNA或RNA分子能够通过其ITR互补配对形成锅柄样（panhandle）环状结构。腺病毒、痘病毒、细小病毒及布尼亚病毒等的基因组均含ITR序列。ITR可能与病毒的复制、转录及整合有关。（invertedterminalrepeat，ITR）

图4-2含末端反向重复序列的病毒基因组形成的锅柄样环状结构+4.长末端重复序列包括重复序列、单一序列5′端：包含许多特定的基因表达调控区域，是一组真核生物增强子和启动子。3′端：具有转录终止的作用。逆转录病毒基因组利用LTR中的重复序列形成环状结构，在整合酶作用下整合入宿主细胞基因组。（longterminalrepeat，LTR）（三）高效基因组1.重叠基因（overlappinggene):病毒基因组的一段DNA序列有两个或两个以上的开放读码框架，可以编码两种或两种以上的多肽链，称为重叠基因。病毒的重叠基因符合遗传节约的原则，使病毒利用有限的基因组序列编码较多的蛋白质。病毒基因组重叠基因ORF1ORF2ORF3ORF4重叠基因图4-3病毒基因组的重叠基因（三）高效基因组2.

很少间隔区：病毒基因组的非编码序列及基因间隔区很少；少数真核生物病毒基因组也存在内含子结构，因此这些病毒的mRNA也涉及转录后加工过程。（四）分段基因组（segmentedgenome）是指病毒基因组由数条不同的核酸分子组成。多见于RNA病毒分段基因组有的包装在同一病毒颗粒中，有的包装在不同的病毒颗粒中，后者见于植物病毒有分段基因组的病毒一般感染效率较低，只有全部基因组核酸片段存在时，病毒才具有感染能力。由于分段基因组易发生重组，故病毒容易变异。病毒基因组的特点1．基因组大小相差很大：HBV：3.2kb痘病毒：300kb2．核酸结构多样性：DNA或RNA单链或双链

环状分子或线性分子3．基因组有连续的，有不连续的大多数连续分段基因组：流感病毒含8条单链RNA8.多为单拷贝,

逆转录病毒除外7.一些病毒基因组的末端具有特殊的序列结构

帽子和poly（A）尾

末端重复序列：正向、反向、LTR；粘性末端6.

基因重叠5.基因有连续的和间断的(有内含子)4.编码序列>90%病毒基因组的特点第二节

DNA病毒基因组DNA病毒基因组双链DNA和单链DNA；线状或环状分子；绝大多数为单一分子，少数分段；这类DNA必须在细胞核内复制；病毒本身不携带以DNA为模板的RNA聚合酶，因此其转录依赖于宿主的转录酶。一、双链DNA病毒基因组疱疹病毒科、腺病毒科和痘病毒科一般都有特殊的结构序列。1.双链线状DNA病毒疱疹病毒科双链DNA有末端冗余；腺病毒科双链DNA有末端有反向重复序列；这些特殊的末端结构可产生粘性末端，能够形成环状或锅柄样环状双链DNA分子。痘病毒科的双链DNA末端有反转发夹结构形成的末端共价交联，形成大的单链环状DNA分子。2.双链环状DNA病毒乳头瘤病毒科、多瘤病毒科和嗜肝DNA病毒科等。乳头瘤病毒科和多瘤病毒科基因组还可以超螺旋形式存在。嗜肝DNA病毒科基因组是一个有部分单链区的不完全环状双链DNA分子，由于嗜肝DNA病毒科的DNA聚合酶具有逆转录酶活性，称其为逆转录DNA病毒。

案例分析：HBV的基因组乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）属嗜肝DNA病毒科是引起病毒性肝炎的主要病原体。我国是有8%～10%的人群携带HBV表面抗原（HBVsurfaceantigen，HbsAg）慢性乙型肝炎的流行率约为1%受HBV慢性感染的人群患肝硬化及原发性肝癌的危险性至少提高300倍。（一）HBV基因组的不完全双链环状结构HBV基因组长约3.2Kb，是不完全双链环状DNA分子，有部分单链区。长链（L）与病毒mRNA互补，为负链，大小为3.2Kb，5′端有末端蛋白共价结合；短链（S）为正链，5′端固定，有帽子结构，3′端不确定，链长度为L链的50%～100%，正负DNA链的5′端互补区域各有TTCACCTCTGC构成的正向重复序列（DR），分别称DR1和DR2，DR在病毒基因组复制及维持基因组环状结构中起重要作用。HBV基因组的不完全双链环状结构

是已知可感染人类又能独立进行复制的双链DNA病毒中最小和最高效的。（二）HBV基因组编码基因HBV基因组上有4个已知的开放读码框架（ORF），都在L（－）链上，S、C、P和X；分别编码外膜蛋白、核壳蛋白、聚合酶及X蛋白。另外还有两个新发现的可能存在的ORF：ORF5在L（-）链上，编码70～100个氨基酸；ORF6是S（+）链上发现的唯一ORF，编码210个氨基酸。6个ORF相互重叠，HBV基因组序列的利用率高达150%～200%。（三）HBV基因组中的调控序列基因组中的每个ORF均有各自的启动子：ORFS的启动子SP1和SP2ORFC的启动子CPORFX的启动子XPHBV基因组有两个增强子：分别位于ORFP和ORFX中poly(A)加尾信号：糖皮质激素效应元件（GRE）U5、DR1及DR2等。（四）HBV基因组序列的多变性基因组复制的逆转录过程，由于逆转录酶缺乏校正功能，使病毒基因组的复制容易发生突变。启动子、增强子等调控序列不易突变，基因组其它区域均可发生突变。基因组的变异常引起如复制缺陷、抗原表位的改变及病毒包装能力的改变等，从而导致HBV致病机制的改变、毒力的改变及血清学检测指标的改变。HBV病毒在肝细胞内的复制二、单链DNA病毒基因组细小病毒科:线状单链DNA5′和3′端有回文序列，可形成发夹结构能够产生两种不同极性的单链DNA，其成熟的病毒颗粒或含正链或含负链DNA；来源于同种病毒颗粒的正负ssDNA能够退火形成双链分子。第三节

RNA病毒基因组RNA病毒基因组线状单链或双链只含一个RNA分子；或含数个RNA分子（即分段基因组）二级结构：参与病毒基因组的转录、翻译和包装的调控。正负链RNA病毒

正链RNA（+RNA）病毒基因组序列与mRNA相同，可直接作蛋白质合成模板具有侵染能力。负链RNA（-RNA）病毒基因组序列与mRNA互补需要以RNA为模板的RNA聚合酶（病毒编码）进行正链RNA的合成双链RNA病毒基因组也无mRNA活性。一、正链RNA病毒基因组均为线状RNA分子单一分子基因组黄病毒科、小RNA病毒科、冠状病毒科、动脉炎病毒科等。基因组RNA一般具5′端帽子和3′端poly(A)尾结构。冠状病毒科RNA，5′端有帽子，3′端有poly(A)尾。小RNA病毒基因5′端没有帽子，但5′端结合一个病毒蛋白VPg，代替帽子。

分段基因组二组分基因组（含2个RNA分子）、三组分基因组（含3个RNA分子）逆转录病毒的基因组：由二个相同的线状正链RNA分子组成，故称二倍体基因组。一、正链RNA病毒基因组二、负链RNA病毒基因组环状：HDV的负链RNA病毒基因组线状：其余的负链RNA病毒单一分子基因组副粘病毒、丝状病毒、博尔纳病毒和弹性病毒分段基因组沙粒病毒、布尼病毒和正粘病毒2段、3段、8段RNA分子沙粒病毒和布尼病毒基因组RNA末端有反向重复序列，可形成锅柄样的环状分子。案例分析----流行性感冒病毒的基因组流行性感冒病毒（influenzavirus），简称流感病毒，属正粘病毒科。根据病毒核衣壳蛋白（NP）及基质蛋白（M）的特征，分甲（A）、乙（B）和丙（C）型。根据病毒颗粒表面的血凝素（HA）和神经酰胺酶（NA）的抗原性，甲型流感病毒又可分为15个HA亚型（H1～H15），9个NA亚型（N1～N9）。甲型能够染人、猪、马和禽类，丙型主要感染人和猪，乙型仅感染人类，是引起人类流感的重要病原。（一）流感病毒的基因组结构特征分节段单链(-)RNA甲型、乙型：8个片段丙型：7个片段组成。亚型：血凝素（HA，H1~H15）；神经酰胺酶（NA，N1~N9）(-)RNA：转录合成mRNA的模板；合成正链RNA的模板每个节段RNA编码1~2个蛋白甲型：8个片段共编码10种蛋白甲型流感病毒H3N2亚型（香港流感）（二）流感病毒基因组的变异病毒的所有RNA两端都有高度保守序列：5′端：5′AGUAGAAACAAGG3′；3′端：5′AGCGAAAGCAGG3′；互补，各RNA片段能够环化形成锅柄样结构；这些保守序列具有启动子的活性。抗原漂移（antigenshift）当宿主细胞同时感染两种亚型的病毒时，毒株之间会发生基因重配现象，子代病毒可获得两个亲代病毒的基因片段，导致子代病毒表面抗原发生变化，从而逃避机体免疫系统的攻击。基因重配引起的抗原转变是流感大流行的重要原因。另外，由于RNA聚合酶缺乏校读功能，不能识别和修复错配的碱基，使流感病毒RNA基因组的复制常常发生点突变，也是流感病毒易发生变异的原因。三、双链RNA病毒基因组单一分子基因组：单组分双链RNA球状真菌病毒科分段基因组：其他双链RNA病毒基因组呼肠孤病毒科、双RNA病毒科、双链RNA球状真菌病毒科等基因组均由2个或2个以上的双链RNA组成呼肠孤病毒科有10~12双链RNA节段。第四节逆转录病毒基因组第四节逆转录病毒基因组逆转录病毒（ReverseTranscribingViruses）DNA逆转录病毒RNA逆转录病毒，即传统意义的逆转录病毒（Retrovirus）HIV病毒所有RNA肿瘤病毒：劳氏肉瘤病毒（RSV）、人T细胞白血病病毒（HTLV）等

逆转录病毒共同的特点能够携带或编码逆转录酶（reversetranscriptase,RT）病毒感染细胞后，先以其RNA为模板，逆转录合成前病毒DNA（provirusDNA）再整合到宿主细胞染色体DNA随细胞基因组的复制和细胞分裂在宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ的作用下，前病毒DNA又能重新转录成子代病毒RNA。一、逆转录病毒基因组的核苷酸组成二倍体基因组:由二条相同的正链RNA在5′端附近通过氢键形成的双体结构。有类似于真核细胞mRNA的5′端的帽子结构（m7GpppGmp）和3′端poly(A)尾。病毒颗粒中还含有小RNA分子，大多数为tRNA，少数为rRNA。此类tRNA的3′端与病毒基因组5′端可互补，在病毒的复制过程中作为引物。

5′m7GpppGmp二、逆转录病毒基因组RNA的结构

3＇

AAA…AAARU5PB-leaderPB+U3RLTRgagpolenvLTR５＇帽－R－U5－PB-－DLS－－gag－pol－env－(onc-)－C－PB＋－U3－R－poly(A)nA：编码区:3个基本结构基因gag:核心蛋白pol:逆转录酶、与前病毒整合相关的酶env:包膜蛋白B：非编码区:与基因组复制和基因表达有关R区:两端的正向重复序列,与cDNA合成有关PB:引物结合区(primerbindingsite,PB)U区:U5含强启动子,起始转录RNA.U3与转录终止和加polyA有关DLS--C区:DLS:两条病毒(+)RNA链结合位点

:包装信号:RNA装入病毒颗粒

C:调控区.案例分析-----人类免疫缺陷病毒的基因组人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）已发现HIV-1和HIV-2两型HIV-1引起人类获得性免疫缺陷综合症

(acqiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)HIV主要攻击辅助性T淋巴细胞，使被感染的细胞死亡或丧失功能，导致免疫系统紊乱和免疫缺陷。（一）HIV的基因组结构特征HIV基因组为双拷贝的单链（+）RNA；两条单链RNA通过5′端的氢键结合在一起，每条RNA的长度为9749bp；有帽子和poly(A)尾，两端各有一个LTR；有gag、pol及env三个基本的结构基因；但HIV还有多种附加基因和调节基因：vif、vpr、nef、tat及rev等；基因编码区常发生重叠，并且mRNA有多种剪接方式，产生数十种mRNA加工产物。HIV-1病毒的基因组结构（二）HIV基因组的变异

HIV基因组是一种高度变异的病毒其中env是变异最大的基因，在HIV-1与HIV-2之间，env的变异率高达58%，在HIV-1不同毒株间，env的变异率也有22%。HIV的高度变异性使HIV能够逃避免疫系统的监视，是疫苗研制的主要障碍。（三）HIV的附加基因和调节基因附加基因（accessorygene）有nef、vif、vpr、vpu及vpx等这些基因的产物功能多样参与病毒的复制、装配、感染和病毒粒子的释放等HIV的调节基因（regulatorygene）有tat、rev等参与病毒的基因表达调控。KEYPOINTSViralg