基因诊断与基因治疗培训教程课件

基因诊断与基因治疗

第二十八章第二十八章第一节基因诊断学基础第二节遗传病的基因诊断第三节传染病的基因诊断第四节肿瘤的基因诊断第五节基因诊断在法医学上的应用第六节基因治疗的概念及策略本章内容提要第一节基因诊断学基础本章内容提要第一节

基因诊断学基础

第一节

基因诊断学基础

基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔科学家用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊断。基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔一、基因诊断的概念、特点及临床意义定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是、，也可以是蛋白质或者多肽。

一、基因诊断的概念、特点及临床意义定义：诊断依据(遗传物质改变)、或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。诊断依据(遗传物质改变)基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性基因诊断的特点二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（）聚合酶链式反应()单链构象多态性（）限制性片段长度多态性（）序列测定（）生物芯片（）免疫印迹（）免疫组织化学诊断二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（）（一）核酸分子杂交

指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。（一）核酸分子杂交

指两条核酸分子杂交流程待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号核酸探针制备探针标记加入标记探针核酸分子杂交流程待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂提取→限制性内切酶消化以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离→变性处理→转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上片段杂交，分析杂交信号。1.印迹杂交()提取→限制性内切酶消化以产生特经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的分子的含量与大小。2.印迹杂交()经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移3.斑点杂交（）将或变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。3.斑点杂交（）将或变性后直接点4.反向斑点杂交

（）先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品或标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。4.反向斑点杂交

（）寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸(,）寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分5.原位分子杂交荧光原位杂交(,）挂锁()5.原位分子杂交荧光原位杂交荧光原位杂交（）荧光原位杂交（）6.固相夹心杂交法

()待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记的A片段）和检测探针（标记的B片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。6.固相夹心杂交法

()待测固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图（二）聚合酶链式反应

(,）模板引物

2+聚合酶变性延伸退火（二）聚合酶链式反应

(,）模板变性延伸在基因诊断中的应用荧光定量多重在基因诊断中的应用1.1.2.荧光定量荧光标记引物2.荧光定量荧光标记引物3.多重多重示意图A：普通；B：多重3.多重多重示意图A：普通；B：多重4.N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因12NHM4.N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因12NHM（三）单链构象多态性分析

（,）的突变造成片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。（三）单链构象多态性分析

（,）分析原理示意分析原理示意正常人纯合突变杂合突变+分析－正常人纯合突变杂合突变+分析－（四）限制性片段长度多态性分析

（,）由于变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或进行检测。（四）限制性片段长度多态性分析

（,）设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在扩增后用该限制酶切割产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一ABCDEFG－＋DEFBGCAEFBG－＋C+DAⅠ限制性内切酶位点的变化ABCDEFG－＋DEFBGCAEFBG－＋C+DAⅠ（五）序列测定（）（五）序列测定（）序列测定原理(双脱氧末端终止法)序列测定原理(双脱氧末端终止法)左侧：正常；右侧突变序列分析用于基因诊断研究左侧：正常；右侧突变序列分析用于基因诊断研究（六）生物芯片（）基因芯片（）蛋白质芯片()

（六）生物芯片（）基因芯片（）基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针灵敏度、特异性高设计合适的引物操作简便、检出率不高选择合适的片段结果可靠但限制较多选择合适的限制酶测序可自动化，但不适宜广泛使用与配合使用生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸三、基因诊断技术路线与方法

直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。三、基因诊断技术路线与方法根据对（一）直接诊断途径必要条件：◆被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系◆被检基因正常分子结构已被确定◆被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知（一）直接诊断途径必要条件：5/——5/—3/3/—1.点突变的检测

（1）有限制性内切酶位点改变5/——5/—3/3/—1.点突变的检测

斑点杂交、反向斑点杂交、、、产物直接测序5/——5/—3/3/—（2）无限制性酶切位点改变斑点杂交、反向斑点杂交5/——5/—3/3/—（2）无限制性在序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。2.基因重排的检测核酸分子探针杂交与在序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个α2α1α21014probe-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血α2α1α21014probe-珠蛋白生成障碍性根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物

等位基因特异（）根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突3.基因表达异常的检测

的相对定量分析的绝对定量分析长度分析3.基因表达异常的检测（二）间接诊断途径1.采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病位点不便检测（二）间接诊断途径1.采用原因

多态性：指群体中的分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.遗传标记2.遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：（基于核酸分子杂交技术）();

()()间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：7.613患者正常的间接基因诊断

——标记的连锁分析Ⅰ7.613印迹杂交NHPN：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针7.613患者正常的间接基因诊断

——标记第二节

遗传病的基因诊断

第二节

遗传病的基因诊断

一、血红蛋白病（）（一）镰状细胞贫血病（二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症

二、血友病（）甲型血友病基因诊断三、脆性X综合征一、血红蛋白病（）

（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断——杂交法

2的限制性内切酶谱分析

3的分析

（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基正常的（N）的探针：5´3´突变的（M）的探针：5´3´1.镰状红细胞贫血患者基因诊断

杂交法正常的（N）的探针：1.镰状红细胞贫血患者基因诊断

杂交法斑点杂交结果N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者杂交法检测正常突变突变

纯合子杂合子纯合子斑点杂交结果N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者杂交法检测正5´3´正常基因1.15(G)×5´3´突变基因1.35(G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析Ⅱ酶切位点（）2.的限制性内切酶谱分析目录5´3´正常基因1.15(G)×5´3´突变基因1.350.21.151.35正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目录0.21.151.35正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血病的3.的分析正常人的扩增产物经Ⅱ消化可生成54和56两个片段，而镰状细胞贫血症患者的片段不被酶切，仍为110，杂合子可见三条带正常人杂合体患者3.的分析正常人的扩增产物经Ⅱ消化可生成54和51.分析-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测M：322I;1:未酶解片段；2：；3：；4：注：由于54、114、72片段及分子量标准中低于200的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症1.分析-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子1-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.反向斑点杂交-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.反向斑点杂二、血友病（）甲型血友病是由于血浆凝血因子（）缺陷造成。甲型血友病的基因突变类型已有300余种，其中点突变占174种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。二、血友病（）甲型血友病是由于血浆凝血因子（）缺陷造成。1.基因倒位的印迹分析将基因组用I，I或I等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为21.5、14和16三种类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14三种类型；Ⅱ型倒位患者表现为20、16和15.5三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。1.基因倒位的印迹分析将基因组2.基因突变的检测（1）依赖于基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析（2）连锁分析（3）分析（4）短串联重复序列（）的连锁分析2.基因突变的检测（1）依赖于基因内或旁侧的多态性标记的连三、脆性X综合征脆性X智力低下基因1（1）5ˊ非翻译区遗传不稳定的()n三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻岛的异常甲基化。正常人中约为8～50拷贝。男性和女性携带者增多到52～200拷贝，相邻的岛未被甲基化，称为前突变（）。男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到200～1000拷贝，相邻的岛也被甲基化，称为全突变（）。全突变可关闭相邻1基因的表达，1在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。三、脆性X综合征脆性X智力低下基因1（1）5ˊ非翻译区遗脆性X综合征常用基因诊断方法1．2．连锁分析3．印迹杂交法4．扩增脆性X综合征常用基因诊断方法第三节

传染病的基因诊断

目录第三节

传染病的基因诊断

目录一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（）系病毒，利用技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组。乙型肝炎病毒（）设计保守区序列引物，扩增各型片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型，以便分型。丙型肝炎病毒（）为正链病毒，先反转录成，再进行巢式检测。目录一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（）目录二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌先设计一对特异性引物，用技术扩增出一383序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。幽门螺杆菌（）主要采用技术：①检测染色体特异片段；②检测尿素酶A基因；③用鉴别菌株。二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌三、寄生虫及衣原体感染疟原虫卡氏肺孢子虫衣原体感染

诊断方法：核酸杂交和技术

三、寄生虫及衣原体感染疟原虫第四节

肿瘤的基因诊断

第四节

肿瘤的基因诊断

一、原癌基因与抑癌基因的检测二、常见肿瘤的基因诊断乳腺癌结肠癌一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1．原癌基因的检测基因家族由、和组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。胰腺癌、结肠癌、肺癌以突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的突变为、或，少数突变为。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主。一、原癌基因与抑癌基因的检测1．原癌基因的检测及分析：扩增基因第12位密码子点突变部位，再用技术进行分析，或者直接测序确定患者原癌基因的点突变。

核苷酸杂交技术（如）：检测基因第12位密码子点突变。2.原癌基因突变常用的检测方法及分析：扩增基因第12位密码子3．抑癌基因p53的检测p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因蛋白。p53的基因诊断方法有（1）分析技术（2）序列分析（3）分析3．抑癌基因p53的检测p53基因以密码子第175位、第2（一）乳腺癌1．乳腺癌常见基因变异5%～10%乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的基因（）的突变。1突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有明显的突变簇或突变热点。70%的缺失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。1在N端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌的高风险相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危有关。2基因在30%～40%的散发性乳腺癌有杂合性缺失（）。突变提高乳腺癌易感性。二、常见肿瘤的基因诊断（一）乳腺癌1．乳腺癌常见基因变异二、常见肿瘤的基因诊断（1）法检测1基因突变（2）荧光原位杂交（）检测2基因扩增2．乳腺癌基因诊断方法（1）法检测1基因突变2．乳腺癌基因诊断方法（二）结肠癌1.结肠癌常见基因变异在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。（）是结肠癌发生过程中第一个突变基因。原癌基因突变也是结肠癌形成的早期事件。（）基因失活是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因4和2也可能会因18q等位基因丢失而失活。p53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。修复基因也与结肠癌有关。如2、1、1或2基因的突变所致的错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。二、常见肿瘤的基因诊断（二）结肠癌1.结肠癌常见基因变异二、常见肿瘤的基因诊断（1）法：对腺瘤样息肉病人基因技术进行分析。（2）异源双链法：检测基因变异。（3）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩短了的蛋白。2．结肠癌基因诊断方法（1）法：对腺瘤样息肉病人基因技术进行分析。2．结肠癌基因第五节

基因诊断在法医学上的应用

目录第五节

基因诊断在法医学上的应用

目重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。串联重复序列散在分布于染色体上。重复单位6～25长，称为小卫星。

重复单位2～6长，如（）n,()n等，称为微卫星。一、指纹与多态性遗传标记重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联可变数目串联重复序列()

人类染色体上小卫星的高度可变区（）是由头尾相连的串联重复序列（，）组成，的核心序列同源性很高，等位的长度由于的重复次数不同而有很大的差别，具高度多态性。可变数目串联重复序列()长度多态除可用印迹杂交法检测外，还可以通过扩增后电泳来检出。扩增片段长度多态（,）长度多态除可用印迹杂交法检测外，还可以通1985年，英国遗传学家等人用的核心序列为探针进行分析时，检测到许多，并产生相应的图谱，所得图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其为指纹图谱（）。

,目录1985年，英国遗传学家等人用的核心序列为探针进行人类指纹图人类指纹图二、指纹与法医学诊断个体识别和亲子鉴定：指纹技术是从基因水平检测的高度多态性，个体识别率高。以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和分型，个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统一认证。二、指纹与法医学诊断个体识别和亲子鉴定：指纹技术是从基因水法医案检中的基因诊断技术（可变数目串联重复序列/小卫星）的核酸分子杂交分析（短串联重复序列/微卫星）的分析的基因芯片检测法医案检中的基因诊断技术（可变数目串联重复序列/小卫星）的核1．单位点探针检测及值的计算父权指数（，）值、父权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一致。值表示争议父作为亲父比随机男人作为亲父的可能性大多少倍，值大于1表示倾向肯定父子关系，数值越大，可能性越大；等于0时表示排除父子关系。1．单位点探针检测及值的计算父权指2．指纹图与亲权鉴定多位点系统和指纹图的电泳分离后片段数目较多，各等位基因频率分布的计算复杂，进行亲权鉴定和个体识别时匹配概率的计算影响因素较多，目前尚无一个公认的最合理的计算方法。目前解决亲权纠纷最简单的办法是先在孩子指纹图中找出非母片段并计数为P，然后分析争议父指纹图，看P条非母带在争议父中出现多少条。2．指纹图与亲权鉴定多位点系统和亲权鉴定与指纹图由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。亲权鉴定与指纹图第六节

基因治疗的概念及策略

目录第六节

基因治疗的概念及策略

目录基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。目录基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。广义基因治疗：①外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；②采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；③将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；④向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。目录狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后本节内容提要

一、基因治疗的策略

二、基因转移技术

三、基因干预

四、基因治疗的应用研究

五、基因治疗的前景与问题目录本节内容提要

一、基因治疗的策略

二、基因转移技术

三、基基因治疗分类体细胞()基因治疗生殖细胞()基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代基因治疗分类体细胞()基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略（一）基因置换（）

定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。（一）基因置换（）定义：指将特定的定向整合的条件:转导基因的载体与基因组具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。基因同源重组技术又称为基因打靶(）细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同源重组技术定向整合的条件:转导基因的载体与基因组具有相同的序列。带有目（二）基因添加（）定义:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。（二）基因添加（）定义:通过导入外源基因使靶细胞表达（三）基因干预（）定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。（三）基因干预（）定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。（四）自杀基因治疗()定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制☻单纯疱疹病毒（,）Ⅰ型胸苷激酶（,）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（,）转变成毒性三磷酸核苷，后者能抑制聚合酶活性，导致细胞死亡。1.自杀基因系统☻单纯疱疹病毒（,）Ⅰ型胸苷激酶（,）基因编码胸定义:“自杀基因”导入后，不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。2.旁观者效应（）定义:2.旁观者效应（）（五）基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强的细胞因子或基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。（五）基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强二、基因转移技术二、基因转移技术基因治疗的两种途径载体目的基因

靶细胞目录基因治疗的两种途径载体目的基因靶细胞目录基因转移()技术1.病毒介导的基因转移2.非病毒介导的基因转移基因转移()技术1.病毒介导的基因转移1.病毒介导的基因转移系统病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。1.病毒介导的基因转移系统病毒载体反转录病毒的结构及生活周期（1）反转录病毒反转录病毒的结构及生活周期（1）反转录病毒两端各有一长末端重复序列。

反转录病毒前病毒的结构特点

由U3、R和U5三部分组成。病毒有三个结构基因5ˊ端下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点()和剪接受体位点()。

含有负链转录的引物结合位点()和正链转录的引物结合位点。在U3内有增强子和启动子；U3和U5两端分别有病毒整合序列()；在R内还有(A)加尾信号。

基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；基因，编码反转录酶；基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

两端各有一长末端重复序列。反转录病毒前病毒的结构特点反转录病毒介导的基因转移系统

——由两部分组成反转录病毒载体：其基因组为缺陷型，保留了病毒的包装信号ψ，而缺失病毒的包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。辅助细胞株(如317)：由另一种缺陷型反转录病毒（即带有全套病毒包装蛋白基因，但缺失包装信号ψ的反转录病毒）感染构建而成。能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。反转录病毒介导的基因转移系统

——由两部

反转录病毒载体的特点

①反转录病毒包膜上编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。

②反转录病毒结构基因、和的缺失不影响其他部分的活性。

③前病毒通过高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。

④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组反转录病毒载体）以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。反转录病毒载体的特点①反转录病毒包膜上编码的糖蛋反转录病毒载体的主要缺点

随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7以下的外源基因。反转录病毒载体的主要缺点（2）腺病毒()载体

腺病毒是一种大分子(36)双链无包膜病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。（2）腺病毒()载体目录目录腺病毒的优点基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导与细胞分裂无关；重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体容量较大，可插入7.5外源基因。目录腺病毒的优点基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导腺病毒载体缺点宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。有两个环节可能产生复制型腺病毒。靶向性差。不能整合到靶细胞的基因组中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。腺病毒载体缺点宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。有两（3）腺病毒相关病毒载体

一类单链线状缺陷型病毒。其基因组小于5，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAVVirusParticles（3）腺病毒相关病毒载体AAVVirusParticle

：病毒复制基因,：编码衣壳蛋白的基因：反向末端重复序列：病毒复制基因,：编码衣壳蛋白的基因：反向末端重的特点以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，基因表达被抑制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表达应激基因，基因表达从而使病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。的特点以潜伏感染为主；载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。目录载体是目前正在研究的一类新型安全载体载体的缺陷载体容量小，目前最多只能容纳5外源片段；感染效率比反转录病毒载体低,在4080%的成人中存在过感染;可能会引起免疫排斥。载体的缺陷载体容量小，目前最多只能容常用基因治疗载体

整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞

腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞<5kb<7.5常用基因治疗载体

整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒2.非病毒载体介导的基因转移系统

（1）脂质体介导的基因转移技术脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:利用阳离子脂质体单体与混合后，可以自动形成包埋外源的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。2.非病毒载体介导的基因转移系统脂质体介导的基因转移示意图目录脂质体介导的基因转移示意图目录（2）受体介导转移技术

将与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的结合，将包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源导入靶细胞。（2）受体介导转移技术将与细胞或组织受体介导转移技术示意图目录受体介导转移技术示意图目录（3）基因直接注射技术不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。

将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ。（3）基因直接注射技术基因直接注射法的优点制备具有调控部件的质粒重组体的技术较容易；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。基因直接注射法的优点制备具有调控部件的质粒三、基因干预（）

基因诊断与基因治疗培训教程课件（一）反义（）

1.反义与基因表达调控利用反义对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义，直接作用于培养细胞，细胞吸收后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义而发挥作用。（一）反义（）反义的关键技术问题☻反义进入靶细胞前的降解问题☻专一性转移问题反义的关键技术问题☻反义进入靶细胞前的降解问题☻2.受体介导反义技转移术①受体介导的转移十分专一，而且效率高；②被转移的是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义转移。2.受体介导反义技转移术①受体介导的转移十分专一，而且效3.反义的优点受体介导的反义基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。

（l）安全性高（2）反义设计和制备方便

（3）具有剂量调节效应

（4）能直接作用于一些病毒3.反义的优点受体介导的反义基（二）核酶()

天然核酶多为单一的分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶分子切断，通过破坏靶分子而达到治疗疾病的目的。（二）核酶()天然核酶多为单一的分核酶锤头状的二级、三级结构只要两个分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。目录核酶锤头状的二级、三级结构只要两个分1.核酶的设计核酶是通过靶分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。

（1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。1.核酶的设计核酶是通过靶分子与核核酶的作用机制核酶的作用机制2.核酶的应用与一般的反义相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到酶的攻击。更重要的是，核酶在切断后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的分子。2.核酶的应用与一般的反义相（三）干扰

1干扰现象干扰（，）是一种由双链诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链有同源序列的信使（）被降解，从而抑制该基因的表达。有义（）或反义（）均能抑制线虫基因的表达，双链比单链更为有效。这与传统上对反义技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义至少高2个数量级。

（三）干扰1干扰现象2干扰的机制

干扰过程主要有2个步骤：

（1）小干扰性（）（2）与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为诱导的沉默复合体（,)。该复合体可识别与有同源序列的，并在特异的位点将该切断长双链被细胞内的双链特异性核酸酶切成21~23个碱基对的短双链，称为小干扰性（，）2干扰的机制干扰过程主要有2个步骤：（1）小干扰性（）（2干扰机制示意图干扰机制示意图研究基因功能的新工具

由于干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段。

研究基因功能的新工具

由于干扰技术1.体外化学合成;2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。的产生1.体外化学合成;的产生四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究（一）遗传病的基因治疗研究

(一)遗传病基因治疗必须符合以下要求1.在水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因的表达不需要精确调控；4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用；5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求的不过只有30余种遗传病。（一）遗传病的基因治疗研究(一)遗传病基因治疗必须符合以下要腺苷脱氨酶()和嘌呤核苷磷酸化酶()缺乏症珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病血友病和其他血浆蛋白缺乏症苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病莱-纳()综合征家族性高胆固醇血症囊性纤维化病目录腺苷脱氨酶()和嘌呤核苷磷酸化酶目录（二）恶性肿瘤基因治疗研究

（1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。（2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；（3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；（4）通过导入“自杀基因”杀伤癌细胞。（二）恶性肿瘤基因治疗研究（1）通过基因置换和基因补充，导入肿瘤基因治疗的常用方法

☻基因干预技术：通过基因干预，抑制肿瘤细胞中过度表达的癌基因，从而降低其恶性表型。☻自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞。☻肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。☻提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。肿瘤基因治疗的常用方法自杀基因治疗

基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地使转染了“自杀基因”的肿瘤细胞“自杀”。自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。自杀基因治疗基本原理：向肿瘤细胞肿瘤的免疫基因治疗

激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括：细胞因子（或受体）基因治疗；抗原抗体基因治疗。肿瘤的免疫基因治疗

临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：（1）患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交叉耐受，最终导致化疗失败。（2）大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：（

药物增敏基因治疗：为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。

提高化疗效果的辅助基因治疗药物增敏基因治疗：提高化疗效果的辅助基耐药基因治疗：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：多药耐药（1）基因编码的糖蛋白、多药耐药相关蛋白（）以及肺耐药相关蛋白等；细胞内氧化和解毒作用的酶系统：细胞色素450（450）、谷胱甘肽转移酶（）以及谷胱甘肽过氧化物酶（）等。向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。耐药基因治疗：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：（三）病毒性疾病的基因治疗研究据统计，75%的人类传染病是由病毒引起的。病毒感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病也存在一定的关联。临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，在众多开展的抗病毒治疗方案中，抗病毒基因治疗十分引人注目。（三）病毒性疾病的基因治疗研究据统1．调节机体免疫应答（1）将细胞因子(如干扰素、白细胞介素等)的基因，导入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和体液免疫应答，促进机体清除病毒感染的细胞和游离病毒。（2）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，表达的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生型致病病毒攻击的防御作用。1．调节机体免疫应答2.抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的（1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。

（2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。

（3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。

（4）干扰技术。

（5）将抗病毒蛋白质基因，如2'→5'腺苷酸合成酶等基因，导入细胞并持续表达，可以激活核酸酶F，降解病毒。主要包括：2.抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计五、基因治疗的问题与展望治疗基因调控元件的选择安全高效载体的构建和转移技术的选择靶细胞的选择五、基因治疗的问题与展望基因诊断与基因治疗培训教程课件谢谢！谢谢！

基因诊断与基因治疗

第二十八章第二十八章第一节基因诊断学基础第二节遗传病的基因诊断第三节传染病的基因诊断第四节肿瘤的基因诊断第五节基因诊断在法医学上的应用第六节基因治疗的概念及策略本章内容提要第一节基因诊断学基础本章内容提要第一节

基因诊断学基础

第一节

基因诊断学基础

基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔科学家用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊断。基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔一、基因诊断的概念、特点及临床意义定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是、，也可以是蛋白质或者多肽。

一、基因诊断的概念、特点及临床意义定义：诊断依据(遗传物质改变)、或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。诊断依据(遗传物质改变)基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性基因诊断的特点二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（）聚合酶链式反应()单链构象多态性（）限制性片段长度多态性（）序列测定（）生物芯片（）免疫印迹（）免疫组织化学诊断二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（）（一）核酸分子杂交

指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。（一）核酸分子杂交

指两条核酸分子杂交流程待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号核酸探针制备探针标记加入标记探针核酸分子杂交流程待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂提取→限制性内切酶消化以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离→变性处理→转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上片段杂交，分析杂交信号。1.印迹杂交()提取→限制性内切酶消化以产生特经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的分子的含量与大小。2.印迹杂交()经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移3.斑点杂交（）将或变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。3.斑点杂交（）将或变性后直接点4.反向斑点杂交

（）先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品或标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。4.反向斑点杂交

（）寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸(,）寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分5.原位分子杂交荧光原位杂交(,）挂锁()5.原位分子杂交荧光原位杂交荧光原位杂交（）荧光原位杂交（）6.固相夹心杂交法

()待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记的A片段）和检测探针（标记的B片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。6.固相夹心杂交法

()待测固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图（二）聚合酶链式反应

(,）模板引物

2+聚合酶变性延伸退火（二）聚合酶链式反应

(,）模板变性延伸在基因诊断中的应用荧光定量多重在基因诊断中的应用1.1.2.荧光定量荧光标记引物2.荧光定量荧光标记引物3.多重多重示意图A：普通；B：多重3.多重多重示意图A：普通；B：多重4.N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因12NHM4.N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因12NHM（三）单链构象多态性分析

（,）的突变造成片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。（三）单链构象多态性分析

（,）分析原理示意分析原理示意正常人纯合突变杂合突变+分析－正常人纯合突变杂合突变+分析－（四）限制性片段长度多态性分析

（,）由于变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或进行检测。（四）限制性片段长度多态性分析

（,）设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在扩增后用该限制酶切割产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一ABCDEFG－＋DEFBGCAEFBG－＋C+DAⅠ限制性内切酶位点的变化ABCDEFG－＋DEFBGCAEFBG－＋C+DAⅠ（五）序列测定（）（五）序列测定（）序列测定原理(双脱氧末端终止法)序列测定原理(双脱氧末端终止法)左侧：正常；右侧突变序列分析用于基因诊断研究左侧：正常；右侧突变序列分析用于基因诊断研究（六）生物芯片（）基因芯片（）蛋白质芯片()

（六）生物芯片（）基因芯片（）基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针灵敏度、特异性高设计合适的引物操作简便、检出率不高选择合适的片段结果可靠但限制较多选择合适的限制酶测序可自动化，但不适宜广泛使用与配合使用生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸三、基因诊断技术路线与方法

直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。三、基因诊断技术路线与方法根据对（一）直接诊断途径必要条件：◆被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系◆被检基因正常分子结构已被确定◆被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知（一）直接诊断途径必要条件：5/——5/—3/3/—1.点突变的检测

（1）有限制性内切酶位点改变5/——5/—3/3/—1.点突变的检测

斑点杂交、反向斑点杂交、、、产物直接测序5/——5/—3/3/—（2）无限制性酶切位点改变斑点杂交、反向斑点杂交5/——5/—3/3/—（2）无限制性在序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。2.基因重排的检测核酸分子探针杂交与在序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个α2α1α21014probe-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血α2α1α21014probe-珠蛋白生成障碍性根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物

等位基因特异（）根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突3.基因表达异常的检测

的相对定量分析的绝对定量分析长度分析3.基因表达异常的检测（二）间接诊断途径1.采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病位点不便检测（二）间接诊断途径1.采用原因

多态性：指群体中的分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.遗传标记2.遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：（基于核酸分子杂交技术）();

()()间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：7.613患者正常的间接基因诊断

——标记的连锁分析Ⅰ7.613印迹杂交NHPN：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针7.613患者正常的间接基因诊断

——标记第二节

遗传病的基因诊断

第二节

遗传病的基因诊断

一、血红蛋白病（）（一）镰状细胞贫血病（二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症

二、血友病（）甲型血友病基因诊断三、脆性X综合征一、血红蛋白病（）

（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断——杂交法

2的限制性内切酶谱分析

3的分析

（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基正常的（N）的探针：5´3´突变的（M）的探针：5´3´1.镰状红细胞贫血患者基因诊断

杂交法正常的（N）的探针：1.镰状红细胞贫血患者基因诊断

杂交法斑点杂交结果N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者杂交法检测正常突变突变

纯合子杂合子纯合子斑点杂交结果N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者杂交法检测正5´3´正常基因1.15(G)×5´3´突变基因1.35(G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析Ⅱ酶切位点（）2.的限制性内切酶谱分析目录5´3´正常基因1.15(G)×5´3´突变基因1.350.21.151.35正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目录0.21.151.35正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血病的3.的分析正常人的扩增产物经Ⅱ消化可生成54和56两个片段，而镰状细胞贫血症患者的片段不被酶切，仍为110，杂合子可见三条带正常人杂合体患者3.的分析正常人的扩增产物经Ⅱ消化可生成54和51.分析-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测M：322I;1:未酶解片段；2：；3：；4：注：由于54、114、72片段及分子量标准中低于200的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症1.分析-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子1-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.反向斑点杂交-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.反向斑点杂二、血友病（）甲型血友病是由于血浆凝血因子（）缺陷造成。甲型血友病的基因突变类型已有300余种，其中点突变占174种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。二、血友病（）甲型血友病是由于血浆凝血因子（）缺陷造成。1.基因倒位的印迹分析将基因组用I，I或I等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为21.5、14和16三种类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14三种类型；Ⅱ型倒位患者表现为20、16和15.5三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。1.基因倒位的印迹分析将基因组2.基因突变的检测（1）依赖于基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析（2）连锁分析（3）分析（4）短串联重复序列（）的连锁分析2.基因突变的检测（1）依赖于基因内或旁侧的多态性标记的连三、脆性X综合征脆性X智力低下基因1（1）5ˊ非翻译区遗传不稳定的()n三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻岛的异常甲基化。正常人中约为8～50拷贝。男性和女性携带者增多到52～200拷贝，相邻的岛未被甲基化，称为前突变（）。男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到200～1000拷贝，相邻的岛也被甲基化，称为全突变（）。全突变可关闭相邻1基因的表达，1在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。三、脆性X综合征脆性X智力低下基因1（1）5ˊ非翻译区遗脆性X综合征常用基因诊断方法1．2．连锁分析3．印迹杂交法4．扩增脆性X综合征常用基因诊断方法第三节

传染病的基因诊断

目录第三节

传染病的基因诊断

目录一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（）系病毒，利用技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组。乙型肝炎病毒（）设计保守区序列引物，扩增各型片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型，以便分型。丙型肝炎病毒（）为正链病毒，先反转录成，再进行巢式检测。目录一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（）目录二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌先设计一对特异性引物，用技术扩增出一383序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。幽门螺杆菌（）主要采用技术：①检测染色体特异片段；②检测尿素酶A基因；③用鉴别菌株。二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌三、寄生虫及衣原体感染疟原虫卡氏肺孢子虫衣原体感染

诊断方法：核酸杂交和技术

三、寄生虫及衣原体感染疟原虫第四节

肿瘤的基因诊断

第四节

肿瘤的基因诊断

一、原癌基因与抑癌基因的检测二、常见肿瘤的基因诊断乳腺癌结肠癌一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1．原癌基因的检测基因家族由、和组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。胰腺癌、结肠癌、肺癌以突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的突变为、或，少数突变为。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主。一、原癌基因与抑癌基因的检测1．原癌基因的检测及分析：扩增基因第12位密码子点突变部位，再用技术进行分析，或者直接测序确定患者原癌基因的点突变。

核苷酸杂交技术（如）：检测基因第12位密码子点突变。2.原癌基因突变常用的检测方法及分析：扩增基因第12位密码子3．抑癌基因p53的检测p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因蛋白。p53的基因诊断方法有（1）分析技术（2）序列分析（3）分析3．抑癌基因p53的检测p53基因以密码子第175位、第2（一）乳腺癌1．乳腺癌常见基因变异5%～10%乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的基因（）的突变。1突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有明显的突变簇或突变热点。70%的缺失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。1在N端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌的高风险相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危有关。2基因在30%～40%的散发性乳腺癌有杂合性缺失（）。突变提高乳腺癌易感性。二、常见肿瘤的基因诊断（一）乳腺癌1．乳腺癌常见基因变异二、常见肿瘤的基因诊断（1）法检测1基因突变（2）荧光原位杂交（）检测2基因扩增2．乳腺癌基因诊断方法（1）法检测1基因突变2．乳腺癌基因诊断方法（二）结肠癌1.结肠癌常见基因变异在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。（）是结肠癌发生过程中第一个突变基因。原癌基因突变也是结肠癌形成的早期事件。（）基因失活是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因4和2也可能会因18q等位基因丢失而失活。p53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。修复基因也与结肠癌有关。如2、1、1或2基因的突变所致的错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。二、常见肿瘤的基因诊断（二）结肠癌1.结肠癌常见基因变异二、常见肿瘤的基因诊断（1）法：对腺瘤样息肉病人基因技术进行分析。（2）异源双链法：检测基因变异。（3）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩短了的蛋白。2．结肠癌基因诊断方法（1）法：对腺瘤样息肉病人基因技术进行分析。2．结肠癌基因第五节

基因诊断在法医学上的应用

目录第五节

基因诊断在法医学上的应用

目重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。串联重复序列散在分布于染色体上。重复单位6～25长，