复方五仁醇胶囊保肝作用的实验与临床研究

复方五仁醇胶囊保肝作用的实验与临床研究

作者：朱浩然窦志华罗琳张兵李民达坤林【摘要】

目的考察复方五仁醇胶囊对损伤肝细胞的保护作用及对慢性肝炎的治疗效果。方法以SD大鼠为供体制备复方五仁醇胶囊含药血清，CCl4诱导大鼠原代培养肝细胞损伤模型，采用血清药理学方法考察含药血清对损伤肝细胞增值（MTT法）和培养上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）的影响；将446例慢性乙型肝炎患者随机分成治疗组和对照组，以临床症状、体征、肝功能为主要指标，考察复方五仁醇胶囊的治疗效果。结果与模型组比较，含药血清组MTT值明显升高，上清液中ALT均显着下降，体系中加入10%含药血清效果最佳；治疗组、对照组临床症状、体征及肝功能指标均明显得到改善，复方五仁醇胶囊的疗效优于阳性对照药护肝片。结论复方五仁醇胶囊对肝细胞损伤具有明显保护作用，对慢性肝炎有较好治疗作用。【关键词】

复方五仁醇胶囊；保肝作用；血清药理学；临床观察Abstract：ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectoftheCompoundWurenchunCapsula(CWC)oninjuredhepatocytepatientswithchronichepatitis.MethodsHepatocyteinjurymodelwasinducedbyCCl4andtheinjuredhepatocyteswereincubatedwithratserumobtainedafteroraladministrationofCWC.Thehepatocyteproliferationrate(MTT)andalanineaminotransferase(ALT)concentrationincellculturemediumweredetermined.446patientswithchronichepatitisweredividedintoexperimentalgroup(treatedbyCWC)andcontrolgroup(treatedbyHuGanTablets,HGT）randomly.Withphysicalsign,symptomandhepaticfunctionasmainindices,thetherapeuticeffectofCWConpatientswithchronichepatitiswasevaluated.ResultsSerumcontainingdrugcouldelevateMTTincrementanddepressALTsignificantly,withthebesteffectataconcentrationof10%.Physicalsign,symptomandliverfunctionofpatientsinexperimentalandcontrolgroupswereallimprovedaftertreatment,andthetherapeuticeffectofCWCwassurpassedtheoneofHGT.ConclusionCWChasanobviousprotectiveeffectoninjuredhepatocyteandpossessesanexactlytherapeuticeffectforchronichepatitis.Keywords：CompoundWurenchunCapsula(CWC);

Liver-protectiveeffect;

Serumpharmacology;

Clinicalobservation

复方五仁醇胶囊是我院经过长期临床实践总结而研制的科研制剂（批准文号：苏药制字Z04001984），处方由五味子、柴胡、叶下珠、三七4味中药组成，具有清热解毒、疏肝活血、补益肝肾作用［1］。初步研究结果表明，该制剂能改善慢性肝炎患者症状和体征、降低血清转氨酶［2］。为了进一步深化开发和推广应用，近年来我们在省市多项科研计划的资助下对复方五仁醇胶囊进行了药效物质基础、作用机理、质量控制标准等较为全面的研究［3～8］。现将有关药效及临床扩大研究的结果报道如下。1

资料与方法1.1

实验研究1.1.1

材料SD大鼠［SPF级，体重（230±19.8）g，♀♂兼用，南通大学实验动物中心提供，许可证号SYKX（苏）2002-0022］；羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，香港FARCO公司，批号L0024LJ0101M21）；乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA，美国AMRESCO公司分装,批号0732）；胶原酶IV（美国Sigma公司分装,批号0406）；胰蛋白酶（美国Sigma公司分装,批号030702）；DMEM培养基（美国GIBCO公司,批号1255136）；新西兰新生小牛血清（美国HyClone公司，批号DPEO166）；溴化3-（4,5-二甲基噻唑）-2,5-二苯基四氮唑蓝（MTT，AMRESCO公司,批号1324B37）；四氯化碳（宜兴市第二化学试剂厂，批号20010608）；复方五仁醇胶囊（本院自制，批号050505）；HERAcellCO2培养箱（德国GmbH公司）；BT-200B数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；BIO-TEK340酶标仪（美国Sigma公司）；日立7170全自动生化分析仪（日本日立公司）。1.1.2

含药血清、空白血清的制备SD大鼠4只，禁食12h(自由饮水)，称重，每天按照4.50ml/kg（相当于成人临床等效剂量的10倍）分两次灌胃复方五仁醇胶囊甲醇提取物的0.5%CMC-Na混悬液，连续给药3d。末次给药后2h以3%戊巴比妥钠1.5ml/kg腹腔注射麻醉，颈总动脉取血，置冰箱4℃冷藏过夜，分离血清，即为含药血清。SD大鼠每天0.5%CMC-Na4.50ml/kg灌胃，同法制备空白血清。1.1.3

肝细胞的分离与培养大鼠用3％戊巴比妥钠1.5ml/kg腹腔注射麻醉，门静脉插管，以37℃无钙灌流液（组成：HBSS500ml，HEPES1.19g，EGTA0.095g，NaHCO30.175g，pH7.4）灌流约20min后，换用37℃的通氧胶原酶灌流液（组成：HBSS100ml，HEPES0.238g，CaCl20.07g，胶原酶IV0.075g，胰蛋白酶0.01g，NaHCO30.035g，pH7.4）继续灌流10min后取下肝脏，剪开肝包膜，将肝细胞悬液过滤清洗后悬浮于含10％新生小牛血清的DMEM培养基中，并用台盼蓝染色法检测细胞活力达90％，以1×105/cm2接种于96孔及48孔板中，置CO2培养箱（5％CO2）37℃培养。1.1.4

肝细胞的分组与处理培养24h后，吸弃上清液，随机分成6组（正常组、模型组及5%，10%，20%，40%含药血清组），每组设6个复孔。模型组和各含药血清组更换为加入CCl410mmol/L的DMEM培养液，正常组相应加入DMEM培养基，正常组和模型组加入终浓度为10％的空白血清，5%，10%，20%，40%含药血清组加入含药血清，使终浓度分别为5%，10%，20%和40%。作用24h后，收集48孔板中培养上清液检测ALT。96孔板中每孔加入5mg/ml的MTT液20μl，继续孵育4h，每孔再加入DMSO200μl，振荡，使结晶物充分溶解，用酶标仪于检测波长570nm，参比波长655nm测定各孔吸光度（A）。1.1.5

统计学处理数据以±s表示，使用wstata7.0统计软件包进行统计处理，样本数据比较采用单因素方差分析和Scheffe检验，以P0.05为显着性判断界值。1.2

临床研究1.2.1

病例选择与分组随机选取446例慢性乙型肝炎患者，均为我院2001～2006年门诊及住院患者，其中男性328例，女性118例；年龄16～69岁，平均37.4岁；病程1～6年。排除合并其他肝炎病毒感染，无心、脑、肾、内分泌等并发症。诊断符合2000年西安全国病毒性肝炎学术会议制订的诊断标准，选择HBsAg（+）、HBeAg（+）或HBV-DNA（+）、ALT80～200U/L、SB35.6μmol/L。病例随机分成两组，其中治疗组264例，对照组182例。两组在年龄性别病情及病程方面具有可比性(P0.05)。见表1。表1

两组患者一般临床资料比较（略）1.2.2

治疗方法治疗组应用复方五仁醇胶囊口服，4粒/次，3次/d。对照组给予护肝片口服，4片/次，3次/d。疗程均为2～4周。1.2.3

观察指标临床症状、体征的变化；肝功能(主要观察ALT)指标变化；不良反应。1.2.4

统计学处理采用χ2检验和u检验。

2

结果2.1

各组含药血清对细胞增殖和上清液中ALT的影响与正常组比较，模型组MTT值显着下降（P0.01），上清液中ALT显着升高（P0.01），说明造模成功；与模型组比较，各浓度含药血清组MTT值均明显升高（P0.01或P0.05），上清液中ALT均显着下降（P0.01）；与10%含药血清组比较，20%，40%含药血清组MTT值明显下降（P0.01或P0.05），5%含药血清组无显着差异（P0.05），5%，20%，40%含药血清组上清液中ALT均明显升高（P0.01或P0.05）。以上结果说明体系中加入10%的含药血清效果最佳。见表2。表2

肝细胞增殖及培养上清液中ALT测定结果（略）与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与10％含药血清组比较，dP＜0.05，eP＜0.01；n=62.2

临床症状、体征变化乏力、纳差的消失率治疗组与对照组无显着差异（P0.05）；肝区疼痛、肝脾肿大消失率，治疗组明显优于对照组（P0.01）。见表3。表3

临床症状体征消失率比较（略）2.3

肝功能变化治疗后两组肝功能ALT均显着下降（P0.01）；治疗组明显优于对照组（P0.05）。见表4。表4

两组患者治疗前后ALT变化情况（略）2.4

不良反应治疗组极少数患者服药后出现胃部不适，减量或停药后消失，无其他不良反应。对照组未见明显不良反应。3

讨论

本次药效研究采用的是体外进行的血清药理学方法，该方法由日本学者首先提出［9］。血清药理学研究方法既能防止中药粗制剂本身理化性质对体外实验的干扰，又能反映中药在胃肠道消化吸收，再经生物转化，最后产生药理效应的过程，因此作为中药研究的新思路和新方法而备受推崇［10］。

实验研究结果发现，体系中加入5%～40%的含药血清均具有一定的保护肝细胞免受损伤的作用，但与10%含药血清组比较，20%，40%含药血清组MTT值均明显下降（P0.01或P0.05），5%含药血清组虽无统计学差异，但也有下降趋势，5%，20%，40%含药血清组ALT均显着升高（P0.01），说明在一定范围内体系中含药血清浓度与药效强度之间具有一定量-效关系，但血清浓度超过一定范围药效反而降低，这可能是由于血清浓度过高又会对细胞产生一定的毒性［11］。

临床观察结果显示，复方五仁醇胶囊对慢性肝炎的治疗效果，在肝区疼痛、肝脾肿大等体征和症状的消失以及ALT下降等方面，均明显优于治疗前（P0.01），也明显优于对照药护肝片（P0.05）。中医学认为，慢性病毒性肝炎的主要病因是湿热疫毒导致肝脾肾脏腑功能失调、阴阳气血亏损。虚者脾虚、肝肾阴虚，实者湿热、瘀毒多见，为虚实夹杂之症。临床治疗应以补益肝肾、疏肝健脾、活血化瘀、解毒扶正为主法。目前市场上以护肝降酶为主要功效的治疗慢性病毒性肝炎的中成药品种不少，但从病因病机出发兼顾以上几方面治法的不多，特别是兼顾活血化瘀的更少。复方五仁醇胶囊在重用五味子护肝降酶的同时，配伍了叶下珠清热解毒、柴胡疏肝理气；三七活血化瘀。诸药合用共奏标本兼治之效，可能是其疗效突出的主要原因之一。【参考文献】

［1］窦志华，施忠，李伟红，等．复方五仁醇胶囊的研制［J］．时珍国医国药，2005，16（10）：953，956

［2］达坤林,王陆军,张兵，等．复方五仁醇胶囊治疗慢性乙型肝炎78例临床疗效观察［J］．时珍国医国药，2006，17（5）：798

［3］窦志华，丁安伟，王陆军，等．复方五仁醇胶囊含药血清