基因芯片技术及其应用

基因芯片技术及其应用摘要进入21世纪以来，生命科学发展日益迅速，基因芯片作为生命科学研究的一种新的技术平台日益受到人们的关注，并已经广泛应用于生命科学研究、医学研究、食品卫生领域以及其它相关的各个学科领域。随着技术的不断完善，基因芯片必将在越来越多的领域里面发挥作用。本文阐述了基因芯片的基本概念及技术流程，简述了其在不同领域的应用，并对其发展前景作了展望。关键词：基因芯片技术流程应用展望GeneChipTechnologyanditsApplicationShuMian(CollegeofHorticulture,SouthChinaAgriculturalUniversityGuangzhou510642,China)Abstract:Lifesciencehasdevelopedrapidlysincethe21thcentury,genechip,asanewtechnicalplatforminthereaseachofLifescience,hasgotincreasinglyattention,andhasbeenusedwidelyinlifescienceresearch>medicalresearch、foodhygienefieldandotherrelateddisciplines.Withthecontinuousimprovementofthetechnology,genechipwillbehelpfulinmorefields.Thisarticleexpoundsthebasicconceptsandtechnologicalprocessofgenechip,givesanintroductionofitsapplicationindifferentfields,andaprospectionofitsdevelopmentprospect.Keywords:genechiptechnologicalprocessapplicationprospection基因芯片(genechip)，又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNAmicroarray)，是生物芯片的一种类型，它是将DNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。作为一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术，基因芯片综合了分子生物学、半导体学、激光、化学染料等领域的最新科学技术，将生物科学与生物信息学很好的联系起来。目前，基因芯片已在生命科学、医学、食品科学、环境科学、农业畜牧业等领域有着广泛的应用。1基因芯片技术原理基因芯片工作原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的，将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于玻片、硅片、陶瓷等固相支持介质上，然后与待测的标记的核酸样品按碱基配对原理进行杂交，再经过一定的检测系统对杂交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号进行数据分析和处理，从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术与传统的杂交技术相比，具有高通量、微型化、自动化、高灵敏性和高速性的显著特点，从而解决了传统核酸印迹杂交(SouthernBlotting和NorthernBlotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目标分子数量少、成本高、效率低等不足。2基因芯片技术的技术流程2.1基因芯片的制作在制作基因芯片之前首先要对目标芯片进行设计，基因芯片的设计实际上是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的，如表达型芯片的目的是在杂交试验中对多个不同状态样品(不同组织、不同发育阶段、不同药物刺激)中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合。对于同一目的基因可设计多个序列不重复的探针，使最终的数据更为可靠。基因芯片的制作方法主要有原位合成与合成后点样两种。2.1.1原位合成法利用光导合成的方法在载体表面逐个合成寡核苷酸，包括光导原位合成法、电压打印法、流体通道合成法、分子印章法、机械点涂法等。目前应用的主要有光导原位合成法、电压打印法等，其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。2.1.2合成后点样法合成后点样法是将合成好的十几至几十个碱基的寡核苷酸或几百个碱基的cDNA片段固定到载体上制成寡核苷酸芯片或cDNA微阵列。如何将寡核苷酸或cDNA稳定地固定在玻片表面是合成后点样法制备基因芯片过程中的一个关键问题，国内外关于芯片制备的方法很多，包括玻璃基片表面的修饰和寡核苷酸、cDNA的末端修饰等。2.2样品的标记从血液或组织中得到的生物样品（DNA或mRNA）一般不能与芯片反应，需进行一定程度的扩增，而且对样品中的靶序列（靶分子）需进行高效而特异的扩增，以获取样品中的靶分子，如cDNA片段、PCR产物、mRNA、寡核苷酸等。靶分子的标记主要采用荧光标记法，也可用生物素、放射性同位素等标记。样品的标记在其PCR、RT-PCR扩增或逆转录过程中进行。常用荧光色素Cy-3、Cy-5或生物素标记dNTP。DNA聚合酶选择荧光标记的dNTP为底物，参与引物延伸，这样新合成的DNA片段中就掺入了荧光分子。对于cDNA,一般是在反转录过程中掺入荧光基因。2.3芯片杂交与杂交信号检测基因芯片与靶基因的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化。因为基因芯片上的杂交属于固相-液相反应，许多因素会影响异源双链的形成，如探针的浓度、长度、杂交的温度、时间、离子强度等，因此，要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交反应条件。待测样品与基因芯片上探针阵列杂交后，漂洗以除去未杂交分子。携带荧光标记的分子结合在芯片特定的位置上，在激光的激发下，含荧光标记的DNA片段发射荧光。样品与探针严格配对的杂交分子，所产生的荧光强度最强；不完全杂交的（含单个或2个错配碱基）双链分子荧光信号弱（不及前者的1/35〜1/5）；不能杂交的则检测不到荧光信号或只检测到芯片上原有的荧光信号。荧光强度与样品中的靶分子含量有一定的线性关系。芯片上不同位点的荧光信号被荧光共聚焦显微镜、激光扫描仪或落射显微镜等检测到，由计算机记录下来，然后通过特制的软件对每个荧光信号的强度进行定量分析、处理，并与探针阵列的位点进行比较，就可得到待测样品的遗传信息。3基因芯片的应用3.1基因芯片在生命科学研究中的应用3.1.1基因表达分析同一组织细胞在不同的发育阶段、不同外界环境因素影响下，其基因的表达模式不同。同一个体的不同组织器官的基因表达模式也不相同。如何研究众多基因表达与否及其表达丰度是人们关注的一个焦点问题。用传统的方法一次只能研究某个基因的表达情况，远不能满足这一要求，而基因芯片技术由于具有高度并行性和高通量的特点正适合于此项研究。在早期的研究中，Schena等（1995）采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Song等（2005）在小鼠体内建立肝癌模型，用基因芯片证实了大量基因参与淋巴转移过程。3.1.2基因突变和多态性分析在进化过程中同一物种不同种群和个体之间存在着不同的基因型，这些不同的基因型与生物个体间不同的性状有着密切的关系。利用基因芯片可以对基因型与性状之间的关系进行研究。Affymetrix公司推出的p53基因芯片可以检测该基因的400多个突变型，而这些突变型又与肿瘤的发生有密切的关系，通过对该基因的检测就可以预测个体肿瘤发生的概率。Claire等（2005）也在研究等位基因的过程中应用了Affymetrix公司的基因芯片技术和生物信息学中的统计学原理，充分证明了基因芯片是种可以快速高效检测基因多态性的良好工具。在植物抗逆机理的相关研究中，Mantfi等（2007）利用微阵列芯片分别对鹰嘴豆进行抗逆基因筛选，通过寒冻敏感型及耐受型鹰嘴豆分别进行寒冻胁迫试验，最后芯片分析结果成功筛选出15个寒冻胁迫相关基因，进而推断出这些基因可能在植物抗寒过程中起到关键作用。3.1.3基因组DNA序列分析由A、T、C、G4种核苷酸单体组合所形成的所有可能把具体寡核苷酸探针共有65536种。将这些种类的探针全部固定于活化的载体表面，形成寡核苷酸阵列。然后芯片与样品进行杂交，通过计算机对杂交模式进行分析，就可以得出样品的核苷酸序列信息。Riki等(2005)利用基因芯片技术测定了芸苔植物基因中mRNA的序列，为揭示其转录规则作出了贡献。3.1.4核酸和蛋白质相互作用的研究蛋白质与特定的核酸片段结合对基因的表达起着重要的调控作用，通过对蛋白质与核酸相互作用的研究，人们可以更深入地了解生命活动的内在机制。对这些DNA片段的研究一般是通过测定DNA发生突变后核酸和蛋白质的结合情况来推测的。这些测定包括硝化纤维素结合反应和凝胶转换分析，但应用这些方法工作量大，操作繁琐。将单链DNA阵列转换成双链DNA阵列，并对这些双链DNA进行修饰(如甲基化)的双链DNA阵列可较好地应用于大规模的核酸和蛋白质相互作用的研究，并且在研究基因组中特异的蛋白质结合位点方面发挥了重要作用。3.2基因芯片在医学领域的应用3.2.1疾病的诊断和治疗目前临床检验需要很长时间，往往结果出来时已经没有参考价值，而且检测结果的特异性差，医生只能根据经验用药。如果在检验中应用基因芯片技术，就可以在短时间内判定是哪一种微生物导致的感染，及时地指导医生的治疗。利用芯片技术还可以对易患某些疾病的高危人群进行普查。此外它还可用于内分泌系统、免疫系统、血液系统等疾病的早期诊断。目前，基因芯片技术对血友病、杜氏肌营养不良症、地中海贫血、异常血红蛋白病、苯酮尿症等的检测均已取得了较大的成功。现在DNA芯片可用于检测遗传性乳腺和卵巢癌基因BRCAI的点突变，插入及缺失等，以及筛查囊性纤维变性基因CFTR和，珠蛋白基因的突变。3.2.2药物的研究和开发在传统的药物筛选方法中，需要从其对应的生化途径起，一步步的在其代谢途径中寻找相关的蛋白或其他物质，之后再去用药物试验。不仅效率难以保证，由于人体内的途径相当复杂，这种方法的局限性也非常大。基因芯片的应用则很好的解决了这个问题，高通量的数据让研究者可以从一个比较全面的角度对药物及疾病的多种参数进行研究，从而对疾病产生的机制和药物相关靶点进行确定。Wilcox等（2007）将黄体酮作用于卵巢癌上皮细胞，以包含有22000种人肿瘤相关基因的基因芯片检测细胞基因表达变化，结果发现MEM97和编码14种胆固醇生物合成酶的基因上调，揭示了黄体酮治疗卵巢癌的分子机制。3.3基因芯片在食品领域中的应用基因芯片在食品领域中也有着广泛的应用，包括在食源性治病微生物检测方面的应用、在转基因食品检测方面的应用、在兽药残留检测方面的应用、在研究食品毒理学中的应用、在抗生素耐药检测中的应用，以及在研究食品营养机理中的应用等等。3.4基因芯片在环境科学领域中的应用近年来，基因芯片技术也被广泛地应用于环境保护，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。3.5基因芯片在农业、畜牧业中的应用对高产品种的选育和保持、用生物技术改良畜群的生产性能及应用转基因、克隆技术生产生物工程产品等，都可以用基因芯片技术取得大量重要信息。将之应用于基因再测序，将大大加快DNA多态型的鉴定，这将有利于推动分子水平的育种工作。同时，通过平行监测基因表达谱，有助于更好地了解动植物生长和发育的机理，以及基因间的相互作用。利用基因芯片技术，对有重要经济价值的农作物、蔬菜和水果等的基因组进行大规模、高通量的研究，筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，以开发高技术含量、高附加值的新产品，也可利用基因芯片技术筛选、开发高效低毒的生物农药。3.6基因芯片在体育科学研究中的应用基因芯片在体育科学研究中的应用主要体现于其在运动心脏研究中的应用、利用基因芯片技术可以进行运动员科学选材以及利用基因芯片进行抗疲劳中药复方成分的筛选研究。基因芯片将有助于探知目前已知的运动能力相关基因与运动能力的具体关系，并且有可能发现新的与运动能力相关的基因，为运动员选材带来不可估量的好处。并有可能对运动处方领域带来重大的影响和促进。应用生物芯片技术开展消除运动性疲劳的复方中药筛选方法研究，将对促进中药消除运动性疲劳，提高机体运动能力具有重大的意义。3.7在军事和司法中的应用在军事、司法方面，基因芯片可用于开发生物战病原体检测系统，研制生物战保护剂，进行血型、亲子鉴定及DNA指纹图谱分析。国外的公司正在开发便携式基因芯片检测装置，它可以直接在犯罪现场对嫌疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储的DNA“指纹”进行比较，以尽快、准确地破案。4基因芯片技术存在的问题与展望4.1基因芯片技术存在的问题基因芯片技术充分利用了生物学、信息学等当今前沿科技成果，发展至今，在诸多领域已呈现出广阔的应用前景，但是仍存在一定的问题，例如DNA芯片上原位合成探针难免有错误核酸掺入及混入杂质，这将增高杂交背景，降低特异性;复杂的寡核苷酸存在的高级结构和自身配对会影响其与靶DNA杂交或形成不稳定的杂交二聚体；由于各实验室设备和处理方法等因素的不同，众多数据间常常缺乏可比性，不利于芯片数据的共享；芯片价格昂贵，实验成本高等。但相信随着芯片制作及杂交条件的不断升级换代，这些问题最终将会得到很好的解决。4.2展望尽管基因芯片技术已经在一些科学研究和医学临床实践中得到了一些应用，但是在一些领域中基因芯片技术还尚处于初步的探索发展阶段，在基因治疗和基因疫苗的研制等方面基因芯片技术还没有得到广泛的应用，但随着生物信息学的进步和发展，基因芯片技术一定会进一步成熟，必将给人类提供越来越多的方便，发挥越来越大的重要作用，它将使科研人员从繁重的常规操作中解脱出来，可以预见在不久的将来它将成为实验室中不可缺少的技术平台和各个领域研究中的重要工具。参考文献于凤池.基因芯片技术及其在植物研究中的应用.中国农业通报，2009,25(06)：64—65于婷婷，韩飞，周孟良.基因芯片在食品研究及检测领域中的应用.现代农业科技，2009,14:318-321王洪水，侯相山.基因芯片技术研究进展.安徽农业科学,2007,35(8):2241-2243,2245付建，黄胜斌，陈磊.基因芯片技术在细菌学研究中的应用进展.湖北农业科学，2009,48(7):1765-1768孙明.基因工程.北京：高等教育出版社，2006.118-132孙兵，闫彩霞，张廷婷.基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展.基因组学与应用生物学，2009，28(1):153—158江禾，王友群.基因芯片技术与药物的研究和开发.世界临床药物，2008,29(2):104-107刘旭伟，焦惠贤.基因芯片技术在肿瘤病理诊断中的应用研究.新疆医学，2008,38:47-49李谨.基因芯片技术的发展与应用.中国兽医杂志，2007，43(8)：87-89李松泰.基因芯片技术在体育科学研究中的应用新进展.西安体育学院学报，2009,26(1):81-85朱玉贤李毅郑晓峰.现代分子生物学.第三版.北京：高等教育出版社，2007.214-218吴玲，聂根新，郑新添.基因芯片技术在现代畜牧业中的应用.现代农业科技，2007,2:171-176张骞，盛军.基因芯片技术的发展和应用.中国医学科学院学报，2008,30(3)：34-37杨东英.基因芯片的技术原理及在动植物研究上的应用.河北农业科学，2008,12(9):53-54杨义强，王春艳.基因芯片技术在药学研究中的应用.齐鲁药事，2009,28(5):293-295房爱华，尹彦涛.基因芯片技术的应用现状及展望.中国畜牧兽医，2009,3