负载肿瘤抗原的DC体外诱导抗肿瘤免疫反应的实验研究

负载肿瘤抗原的DC体外诱导抗肿瘤免疫反应的实验研究作者：才子斌王毅李薇赵恒军刘春水王芳作者单位：吉林大学第一医院，吉林长春130021【摘要】目的研究自体及同种异体树突状细胞(DC)体外负载肿瘤抗原后刺激T淋巴细胞增殖及诱导抗肿瘤免疫反应的能力。方法利用细胞因子诱导人骨髓单个核细胞生成DC，尼龙毛柱法分离T淋巴细胞，3HTdR掺入法检测负载肺癌细胞凋亡小体的自体及同种异体DC体外刺激T细胞增殖反应，乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测负载肺癌细胞凋亡小体的自体及同种异体DC刺激的T细胞对肺癌细胞和乳腺癌细胞系MCF7的杀伤作用。结果骨髓细胞诱生的自体及同种异体DC负载肿瘤抗原后，均具有刺激T淋巴细胞增殖的能力，负载肿瘤抗原的自体及异体DC激活的T淋巴细胞后均可杀伤两种靶细胞，T细胞对MCF7的杀伤力明显低于对患者肺癌细胞的杀伤力。结论人自体或异体DC体外负载细胞性肿瘤抗原后，可有效地刺激T淋巴细胞的增殖，产生特异性肿瘤杀伤作用。【关键词】树突状细胞骨髓单个核细胞抗肿瘤免疫反应T细胞负荷抗原T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中最先发生并始终占据着主导地位。因此，有效激活T淋巴细胞的活性是肿瘤治疗的一种有效手段〔1〕。体内存在大量不具增殖和杀伤能力的初始T细胞，肿瘤细胞自身没有能力激活它，而两者之间存在一种反应的介导者，这就是具专职抗原递呈能力，能激活初始T细胞的DC〔2〕。DC能摄取各类抗原，利用其自身高表达的MHC分子、共刺激分子及黏附分子等，将双刺激信号传递给T细胞，从而诱导特异性CTL，以放大免疫效应而发挥作用，因此有人称DC是架在CTL与肿瘤细胞之间的桥梁〔3〕。本研究利用通过人骨髓单个核细胞(MNC)诱生出的DC和利用60G0源照射诱导出肺癌细胞凋亡及其凋亡小体，进行了自体及同种异体DC体外负载肿瘤抗原后刺激T淋巴细胞增殖及诱导T细胞产生抗肿瘤免疫反应的实验研究。1资料与方法1.1实验动物及细胞系肿瘤细胞株：MCF7(人乳腺腺癌)细胞株由本院中心实验室提供。肺癌细胞：本院胸外科肺癌患者手术取得的肺癌组织原代培养获得。均用含10%小牛血清DMEM培养液，37℃，5%CO2饱和湿度下培养。1.2骨髓单个核细胞扩增并诱导DC见文献〔4〕。1.3分离T淋巴细胞(尼龙毛柱法)〔5〕将肺癌患者外周血分离的单个核细胞悬浮于10ml的含有RPMI1640的培养基中，5%CO2、37℃培养2h，将非贴壁细胞以含5%FCS的RPMI悬浮，注入T细胞尼龙毛柱，37℃孵育1h，再将T细胞尼龙毛柱取出，冲洗出非黏附细胞为T细胞，以含10%FCS，IL2(100U/ml)的RPMI1640培养。1.4负载肺癌细胞凋亡小体的自体及同种异体DC体外刺激T细胞增殖反应〔6〕以负载肿瘤抗原后的自体及同种异体DC作为刺激细胞，调DC浓度为1×105/ml，取100μl细胞加至96孔培养板中，设6复孔。用1640完全培养液悬浮T细胞后，调细胞浓度为2.5×106/ml，按一定的梯度(5×104/孔、2×105/孔、1×105/孔)加入实验孔作为反应细胞。设单独反应细胞和单独刺激细胞作为阴性对照，用培养液将每孔体系补足200ml。37℃，5%CO2培养4d后，加入0.5μCi/孔的3HTdR，继续培养16h。细胞收集器将细胞收集在滤纸上，反复(至少10次)冲吸培养孔。静置过夜。将干燥的滤纸片加入液闪瓶，每瓶含5ml闪烁液，β液闪仪计数cpm值。计算刺激指数(SI)：SI=刺激管的cpm值/对照管的cpm值1.5检测负载肺癌细胞凋亡小体的自体及同种异体DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(LDH释放法)〔7〕以RPMI1640(含10%FCS)重悬T细胞和已负载肺癌细胞凋亡小体的自体及异体DC，分别调细胞浓度为1×106/ml、1×105/ml和1×104/ml。取T细胞和已负载抗原的自体DC各1ml加入6孔板中共培养，再取T细胞和已负载抗原的同种异体DC各1ml加入6孔板中共培养，最后取T细胞和1640培养液各1ml加入6孔板中培养，按2000U/ml加入IL2，37℃，5%CO2培养24h。将T细胞和DC共育24h的细胞悬液及T细胞单独培养悬液离心、弃上清，以RPMI1640(含5%FCS)重悬配成2ml体系。以RPMI1640(含5%FCS)重悬肺癌细胞、MCF7两种靶细胞，调细胞浓度为1×104/ml。实验组按效∶靶=50∶1，分别取T细胞和DC的混悬液及T细胞悬液各100μl加入96孔板，每孔再加入靶细胞悬液100μl，设六复孔。同时设靶细胞自然释放对照(100μl靶细胞悬液+100μl1640)和最大裂解对照(100μl靶细胞悬液+100μl1640)、效应细胞自然释放对照(100μlT细胞和DC的混悬液+100μl1640;100μlT细胞悬液+100μl1640)、培养基背景对照(200μl1640)、容积纠正对照(200μl1640)，设六复孔，37℃，5%CO2孵育4h。孵育结束前45min，在容积纠正对照组和最大裂解对照组中各孔加10μl细胞裂解液。孵育后离心，250g，4min。各孔取50μl上清，分别加入50μl显色底物，避光，室温置30min。每孔加50μl终止液。1h内在酶联仪上490nm处检测OD值。待测孔OD值-效应细胞自然释放孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值/靶细胞最大裂解孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值×100%注：待测孔和自然释放孔的值为实测值-培养基背景对照值，最大裂解孔值为实测值-容积纠正对照值1.6统计学处理数据用x±s表示，采用两样本均数比较的t检验。2结果2.1负载肺癌细胞凋亡小体的自体及同种异体DC体外刺激T淋巴细胞增殖反应在负载肺癌细胞凋亡小体的自体及同种异体DC刺激T细胞增殖反应中，选择了三种T细胞与DC细胞混合的比例(20:1;10:1;5:1)，三组的3HTdR掺入量见表1、表2，分别与各自的对照组比较，均P<0.01，说明骨髓细胞诱生的自体及同种异体DC负载肿瘤抗原后，具有刺激T淋巴细胞增殖的能力。其中，以5:1时刺激指数(SI)最高，说明这种比例条件下，刺激作用最明显。表1负载肿瘤抗原的同种异体DC刺激T淋巴细胞增殖(略)表2负载肿瘤抗原的自体DC刺激T淋巴细胞增殖(略)2.2负载肿瘤抗原的DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用负载肿瘤抗原的自体及异体DC分别激活T细胞后再与两种靶细胞作用，通过检测靶细胞内LDH的释放量评价效应细胞对靶细胞的杀伤性。T细胞加DC组的OD值与对照组单独培养的T细胞组的OD值相比，均P<0.01。说明T细胞经自体及异体DC刺激增殖后对两种不同的肿瘤细胞都产生了明显的杀伤作用。但由于MHC的限制性，异体DC所刺激的T细胞的细胞毒作用较自体DC所刺激的T细胞的细胞毒作用弱。表3可见，两种靶细胞中，T细胞对MCF7的杀伤力明显低于对患者肺癌细胞的杀伤力，说明经DC提呈肿瘤抗原后在刺激T细胞后，T细胞的细胞毒作用具有高度的特异性。表3负载肿瘤抗原的自体及异体DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(略)3讨论有实验表明，DC具有体外激发同种异体T淋巴细胞增殖的能力，DC表面的HLA分子作为一种抗原物质刺激异源的T淋巴细胞分裂增殖〔8〕。为比较自体及同种异体DC刺激的T细胞的杀伤肿瘤细胞的活性及两种DC所诱导CTL的特异性，我们选择了自体肺癌细胞、MCF7两种肿瘤细胞作为靶细胞加入自体及同种异体DC与T细胞的混悬液中，通过LDH释放法检测T细胞的杀伤性，通过3HTdR掺入法，计数淋巴细胞内的放射量，即可推知淋巴细胞转化的程度，客观地反映淋巴细胞对刺激物的应答水平，从而判断DC的功能。结果显示：自体及同种异体的骨髓细胞来源的DC负载肿瘤抗原后对T细胞具有很强的刺激活性，但异体骨髓来源DC负载肿瘤抗原后能刺激产生更强T细胞增殖效应，而且随着R/S的降低，SI增高。本实验观察到尽管异体骨髓来源的DC负载肿瘤抗原后所刺激的T细胞的增殖更强一些，但自体负载肿瘤抗原的DC能够诱导出更强的抗自身肿瘤细胞的CTL活性，并且负载自体肿瘤抗原后的两种DC抗自体肺癌细胞的CTL活性远大于其抗MCF7乳腺癌细胞的活性。结果均支持自体肿瘤抗原经自体或异体DC在体外负载并回输的抗肿瘤疫苗的制备方法能够应用于临床。分析其原因可能为：(1)肺癌细胞性抗原经自体或异体DC提呈后均有效诱导出抗肿瘤CTL，通过MHCI类分子限制性机制溶解自体肺癌细胞。自体DC是通过MHCI类分子提呈肺癌细胞性肿瘤抗原的。而且，自体DC还能通过MHCII类分子提呈肺癌细胞性肿瘤抗原，并刺激辅助型CD4+细胞。而异体DC提呈的肺癌细胞性肿瘤抗原能够刺激异体反应性T细胞并释放细胞因子，并激活肿瘤特异性的CTL〔9〕。(2)已提呈自身肿瘤抗原DC所诱导T细胞对自体肺癌细胞的杀伤活性远大于对MCF7乳腺癌细胞的杀伤活性。这是因为：DC通过表达MIHI、II类分子可将自体肺癌细胞性抗原提呈给T细胞，同时DC表面表达CD80、CD86等共刺激分子，从而激活T细胞并对自身的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用〔10〕，因MCF7未经DC提呈，其本身抗原性处于低表达或不表达，从而不能有效地激活T细胞产生特异性杀伤作用。因此，其CTL杀伤力远低于前者。抗肿瘤CTL的产生为限定免疫反应性的靶位提供了机会。因此，尽管筛选已知抗原结合于HLAA2分子的方法代表一种途径，用DC提呈肿瘤细胞全抗原诱导抗肿瘤CTL的产生代表另一种限定免疫反应性靶位的新方法。目前结果表明，人自体或异体DC体外负载细胞性肿瘤抗原后，可作为抗肿瘤免疫治疗的潜在方法，具有广阔的临床应用前景。【参考文献】1McmichaelAJ.TheoriginalsinofkillerTcells〔J〕.Nature,1998;394:4212.2Schultze，NadlerLM，GribbenJG,etal.B7mediatedcostimulationandtheimmuneresponse〔J〕.BloodReview，1996;10:11127.3SantegoetsSJ，BontkesHJ，StamAG，etal.InducingantitumorTcellimmunity：comparativefunctionalanalysisofinterstitialversuslangerhansdendriticcellsinahumancelllinemodel〔J〕.JImmunol,2008;1;180(7):45409.4才子斌，王芳，李薇，等.体外诱导人骨髓单个核细胞生成树突状细胞的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(8)：7235.5杨廷彬，尹学念.实用免疫学〔M〕.长春：长春出版社，1994：558.6TakahashiH，NakagawaY，YokomuroK,etal.InductionofCD8+cytotoxicTlymphocytesbyimmunizationwithsyngeneicHIV1envelopederivedpeptidepulseddendriticcells〔J〕.IntJImmunol，1993;5:84957.7NestleFO，AlijagicS，GillietM,etal.Vaccinationofmelanomapatientswithpeptideortumorlysatepulseddendriticcells〔J〕.NatMed，1998;4:32832.8GalettoA，ContariniM，SapinoA,etal.Exvivohostresponse