《抗生素与化学治疗》

《抗生素与化学治疗》美国微生物协会版权所有（中译文初稿）抗病毒剂-爱力诺力克钙的特异性约翰·海思兹，阿瑟·海厄，菲利普·卡尔英国伊利诺伊州厄巴纳伊利诺伊大学微生物系61801爱力诺力克钙是一种抗病毒刑，可抑制逆转录酶，鸡胚胎成纤维细胞生长，同时还可抑制大肠杆菌菌株和枯草杆菌菌株。体外的药剂抑制大肠杆菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶以及其他一些酶。通常的DNA聚合酶鉴定成分，除了亚精胺外，对已观察到的抑制性没有影响。药剂对DNA聚合酶II的抑制性看来是由于对酶直接的，不可逆转的影响造成的。然而，大肠杆菌里的DNA合成并不比细胞团的增长更容易受药剂的影响。这些结果表明爱力诺力克钙是一种低特量抑制剂。爱力诺力克钙是从经过微酸催化的橄榄的汁液中分离出来的一种单帖，—种体外杀病毒刑，可以杀大量RNA和DNA病毒。它也会减少感染副流感病毒的仓鼠所携带病毒的生长，应用于动物时，毒性很小。爱力诺力克钙抑制莫洛尼氏白血病毒和劳舍尔氏白血病病毒的RNA依赖的DNA聚合酶(逆转录酶)，当爱力诺力克钙浓度为20ug/ml时，抑制率达到50％：此药剂好象不会和核酸制剂或DNA或RNA发生反应。经证明，此药剂直接抑制逆转录酶。在早期潜伏期，用2—M等量的氨基乙酸，离氨酸，半胱氨酸或组氨酸可以使此药利灭活，用其他氨基酸则无效。要灭活此药剂，必须有一个游离氨基酸组，然而，此药剂在浓度高为200ug/ml，不会对埃希氏大肠杆菌RNA聚合酶或DNA聚合酶I起抑制作用。最近曾经有过关于爱力诺力克酸的结构和盐酸甲基爱力诺力克的总合成的报道。我们需要判断此药剂是否抑制大肠杆菌DNA聚合酶11或III，因为逆转酶在很多特性上部和这些酶非常相似。大肠杆菌酶的一种特定抑制剂可能对阐明细胞中这些酶的生理作用很有帮助。然而，两种酶受到抑制的程度很相近，而且进一步的研究表明此药剂并非特效材料和方法材料：细胞培养皿是用猎鹰塑科做的。改良细胞培养液干粉，磷酸胰化蛋白稀释液，小牛血清和鸡血清是从格兰德艾兰生物化宇公司获得的。[3H]胸腺嘧啶，7．OCi/mmol是从施瓦茨/曼购买的。[3H]胸甘，5—三磷酸，50Ci/mmol购自NewEnglandNuclear公司。小牛血清DNA(V型)是从西格玛购得的，将胰去氧核糖核酸水解晦(脱氧核糖核酸酶I)水解(渥新顿，EC3．1．4．5)以便使DNA聚合酶III获得最大的活性。爱力诺力克钙，项目9426—JHF2是卡拉麻组，米奇的美国普强公司献给世人的一个丰厚的礼物。当把此药利以1：lOmg/ml的浓度溶于水中并冷冻保存时，它可以通过反复的冻结和融化维持至少两个月的稳定性：细菌的滋长：大肠杆菌菌株W3110(thyA36和dra-2)和D)10(polAl，endA—，thyA36和dra—2)是从美国康乃秋克州的纽哈芬市的大肠杆菌基因库中心获得的。尤金内斯特分离出来的枯草杆菌原养型菌株WB746是从萨穆尔．卡普兰处获得的。细菌生长在M9基本培养基中，并补充以0．2％葡萄糖，lmm无水硫酸镁和每毫升4ug胸腺嘧啶：平板培养基可以用1.5％的琼脂(Difco)来使之凝固。细胞团是光学密度在为450nm时由ZeissPMQll分光尤度计确定的。总的细胞数是通过在Petroff-Hauserchamber记数200别400个细胞来确定的。成活细胞的数量是通过适当稀释以后用M9琼脂作为平板来确定的：DNA合成是通过把[H]胸腺嘧啶包含列不溶酸含量中去水测定的。鸡胚胎成纤维细胞的生长:主要的鸡胚胎成纤维细胞，正如前面所描述的那样，是用十天大的鸡胚胎准备的。这些细胞经过在38℃下四五天的生长，从细胞培养皿中被移出，浸泡在有0．05％胰蛋白酶的三羟甲基氨基甲烷，三羟甲基盐酸(25mM三羟甲基盐酸[pH7．3]，140mM氯化钠，5mM氯化钾和0．7mM磷酸二氢钠)中并置于10个细胞/35mm的细胞培养皿中。细胞被培植在41℃的含10％磷酸胰化蛋白稀释液，4％小牛血清和1％的遇热处理使之不活化的鸡血清的改良细胞培养液中。所有的实验在于皿接种24小时后开始。细胞的增长速度是在把细胞用三羟甲基盐酸中的0．25％的胰蛋白酶和0．1％葡萄糖从培养皿中移走后通过颗粒计数器来测定的。锥虫蓝和0．9％的盐水被摄取用来估计细胞的成活率。在几次实验中，细胞是用胰化蛋白缓和的盐水冲洗的，此盐水中含有140mM氯化钠，5．4mM磷酸二氢钠，5mM氯化钾，1.8mM氯化钙，lmM磷酸二氢钠，0．

酶的抑制性研究

鸡的蛋白溶菌酶(A等，EC2．3．1.17)是从西格玛购进的。内切核酸酶(NFCP，EC3．1．4．7)和胰脏脱氧核糖核酸酶{(DPFF，EC3．1．4．5)是从渥新顿购得的。将这些浓度为40—50ugml的酶在37℃下暴露于5mM三羟甲基盐酸中的酸碱度为8．0的爱力诺力克钙半个小时，然后按照供应商所描述的进行鉴定。将大肠杆菌DNA聚合酶II用Kornberg和Geftcr的方法进行提纯，紧接着是透析，磷酸纤维素层析法和葡聚糖凝胶G—100凝胶过滤法。这种酶有125Ums的最终比活度，并按Ottoet．al所推荐的进行储存。DNA聚合酶II的标准鉴定含(0．3ml—体积)：33mM三醋酸缓和物(酸碱度7．2，30℃)，50mM氯化钾，16．7mM二硫苏糖醇，13．3mM氯化镁，280uM(核苷酸)经过脱氧核糖核酸酶水解过的小牛胸腺DNA，33uM(每个)脱氧腺苷三磷酸二钠，deoxyeytosine三磷酸二钠，脱氧胞苷酸和[3H]脱氧胸苷三磷酸二钠(150counts/min每毫克蛋白)，大约0．7ug酶(通过假定270U/mg比活度的制剂的纯度很高来估箅的)和爱力诺力克钙的浓度。37℃下的潜伏时间为30分钟，参入核甘酸的不溶酸产品用前面所描述的方法测量。DNA聚合酶III全酶的原提取液是按照Wickner和Kornberg所描述的进行准备的，培植在M9中，并辅以1％的葡萄糖和0．2％的酸水解酪素(Difco)3．5X108／m1。DNA聚合酶III全酶的标准鉴定包含(0．3ml体积)：33mMmoroholinopropane磺酸氢氧化钾缓和物(酸碱度7．0)，16．7mM二硫苏糖醇，6．7mM氧化镁，5mM氯化钠，1．4mM(核苷酸)经过脱氧核糖核酸酶水解过的小牛胸腺DNA，1.3mM腺苷三磷酸二钠，0．15mg/每毫升大肠杆菌磷脂质，133uM脱氧腺苷三磷酸二钠，deoxycytoslne三磷酸二钠，脱氧胞苷酸和[3结果

酶抑制性的光谱:如图表l中所示，爱力诺力克钙对大肠杆菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶有抑制作用。和以前发表的报导相一致的是，控制实验(数据没有出示)表明爱力诺力克钙对DNA聚合酶II的抑制性不受任何一个DNA聚合酶II或DNA聚合酶III全酶鉴定因素的影响，除了亚精胺外，这一结果没有用于DNA聚合酶III全酶在提取液中活性情况的测定，因此，这两种酶在易受影响状况方面的明显差异不能用二者在酶鉴定方面的差异来解释。

爱力诺力克钙对DNA聚合酶II活动性的抑制作用，不能通过增加DNA，脱氧核(糖核)苷三磷酸盐或镁的浓度来克服，但是可以通过增加酶的浓度来克服(图表1)。因此，抑制性看来是针对酶自身的。而且，爱力诺力克钙对DNA聚合酶II的抑制作用看来是不可逆转的(图表1)。将DNA聚合酶II在37℃

图1

爱力诺力克钙对几种酶的抑制作用。在无药剂的情况下所观察列的酶的活动被视为100％。

符号：△微球菌核酸酶；○鸡的蛋白溶菌酶；●大肠杆菌DNA聚合酶II；□大肠杆菌DNA聚合酶III全酶；▲胰脏脱氧核糖核酸酶,图表l影响爱力诺力克钙对DNA聚合酶抑制作用的因素指数条件观察到的抑制性（%）标准鉴定条件42把DNA浓度增加五倍到1.4mM40把脱氧核（糖核）酸苷三磷酸盐的浓度增加到每个133uM42把镁的浓度稀释四倍到3.3mM39把酶的浓度增加四倍27把酶的浓度增加十倍18将酶在37℃66

此图表表明了DNA聚合酶II的标准鉴定以及200ugml的爱力诺力克钙的抑制活动。鉴定配合比中爱力诺力克钙的最终浓度为17ug/ml，对DNA聚合酶II的抑制作用微乎其微(表1)。然而，在此次实验中，和暴露于水相比，DNA聚合酶II在暴露于爱力诺力克钙时受列更强烈的抑制，这表明暴露于500ug/ml的爱力诺力克钙的影响是不可逆转的。

表l还表明了爱力诺力克钙对其他几种酶活动的影响。尽管胰脏脱氧核糖核酸酶I仅仅在药剂配制为高浓度时才受到轻微的抑制，溶菌酶和微球菌核酸酶较之DNA聚合酶II更易受到爱力诺力克钙的抑制。实际上，微球菌核酸酶，50％的活动性在浓度为2ug／ml时受到抑制，受药剂影响的程度是滤过性毒菌逆转酶的10倍。

大肠杆菌体内靶的抑制性

对大肠杆菌里的DNA复制至关重要的DNA聚合酶III受到了爱力诺力克钙的抑制，因此我们想确定大肠杆菌里的DNA合成是不是首先受到体内爱力诺力克钙的抑制。早期的实验表明枯草杆菌WB746和大肠杆菌w3110的生长受到了爱力诺力克钙的抑制。因此我们就爱力诺力克钙对大肠杆菌生长培养物的指数增长进行了观察(表2)。表2A是对照标准，表明这些细胞在快速平衡地增长，就象所有参数的平行增长所表明的一样。

表2B表明200ug/ml(0．75mM)的爱力诺力克钙的作用。此药剂在这个浓度表现为抑制菌，因为在暴露于此药剂20分钟后，所有的参数从60分钟倍增时间平行变为75分钟倍增时间。值得注意的是，即使在此药剂浓度对此菌株的生长产生很小影响的时候，DNA合成看起来比细胞团的增氏更容易受到抑制。

表2C表明500ug/ml(1.88mM)的爱力诺力克钙的影响。在暴露于此药剂20分钟后，DNA合成，细胞分裂和细胞生长全部停止了。此药剂在这个浓度上看起来是一种高抑制菌，因为在添加了此药剂后，成活细胞的数量大幅度下降。

爱力诺力克钙对鸡胚胎成纤维细胞的影响。据报导，浓度为200ug/m1的爱力诺力克钙对培养液中的鼠胚胎成纤维细胞无毒性：我们发现配制为此浓度的药剂减缓了大肠杆菌的生长速度，同时也对大量体外酶起到了抑制了作用。因为爱力诺力克钙会受到细胞培养液中氨圣酸的灭活，我们在几次不同的实验条件下对此药剂对培养液中鸡胚胎成纤维细胞的影响进行了调查(图表2)。这些细胞用磷酸生理食盐水冲洗以去除培养液中的氨基酸后，暴露于磷酸生理食盐水中的爱力诺力克钙20分钟，配制为500ugml浓度的药剂土观出毒性，而200ug/ml浓度的药剂大幅度减缓了细胞的生长速度：配制的浓度为50ug/rnl的药剂对生长速度则无任何影响。然而，正如图表2中所示，爱力诺力克钙对鸡胚胎成纤维细胞的影响在很大程度上依赖于培养液和暴露于此药剂的时间的长短。即使采用最温和的实验条件(在生长培养液中暴露30分钟)生长速度也会受到200ug／ml的爱力诺力克钙的轻微抑制。

表2:爱力诺力克钙对在27℃下在M9培养液中的大肠杆菌W3110的指数增K的影响。按照箭头所指的时间，[3讨论

这些有关爱力诺力克钙的研究表明此药剂抑制大肠杆菌菌株和枯草杆菌菌株的生长。此药剂对体外大肠杆菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶具有抑制作用。酶在受影响程度方面的细微差别不能用酶在鉴定条件方面的差别来解释，但是可以反映出在酶制剂纯度方面的一些差别，因为此药剂似乎对DNA聚合酶II会起直接的不可逆转的化学反应，同时抑制几种不相关的酶。爱力诺力克钙似乎并不是起着一种传导阻滞硫基剂的作用，但是会被氨基酸和亚精胺灭活。此药剂似乎会和自由氨基起化学反应。尽管DNA聚合酶II和III会受到体外爱力诺力克钙的抑制，大肠杆菌里的DNA合成并不比细胞团的增氏更容易受到此药剂的影响。这些观察表明大肠杆菌里爱力诺力克钙的主要作用可能是通过与自由氨基和蛋白质的共价反应宋抑制生长。图表2爱力诺力克钙对鸡胚胎成纤维细胞生长的影响指数爱力诺力克钙（g/ml）倍增时间率（实验培养液/对照标准液）1501.00

2003.67

500—b22001.14

5001.213d2001.71

5004.00

a细胞用磷酸生理食盐水冲洗两次并在磷酸生理食盐水中暴露于此药剂20分钟，然后再在调湿的介质加入之前用磷酸生理食盐水洗两次。

b经过五天的时间，细胞数量有轻微的下降。在暴露于此药剂12小时后，90%多的细胞渗透到锥虫蓝中。

c细胞暴露于在生长液中的此药剂30分钟，然后再在调湿的介质加入之前用磷酸生理食盐水洗一次。

D细胞不断地暴露于培养液中的次药剂。

爱力诺力克钙也会影响鸡胚胎成纤维细胞在培养液中的生长速度．影响的程度依赖于药剂的浓度和实验条件。我们的结果表明当我们检查爱力诺力克钙的抗病毒效果的时候，必须十分小心，因为不仅很多酶有可能被抑制，而且培养液中的细胞自身有可能受到药剂的影响，这取决于药剂的浓度和实验的原始记录。

爱力诺力克钙看来是一种低特量抑制剂。它看起来只和一定氨基酸的氨基发生反应，