DNA重组质粒的构建概述

DNA重组质粒的构建医学生物所病毒免疫室基因克隆genecloning应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。核心技术：DNA重组技术

（recombinantDNAtechnique）基因克隆的基本程序：

分—切—接—转—筛PCR酶切连接转化&转染抗性或标记筛选目的基因DNA片段的获得外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞重组DNA分子克隆的筛选和鉴定目的基因或其表达产物的纯化和鉴定基因克隆技术的特点：

1.可在体外人工的,有目的的,根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；

2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。基因克隆示意图胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体例：干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。DNA重组操作过程载体外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞abbA重组Ab抗性筛选重组筛选重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增

DNA片段和载体的酶切

片段DNA与载体的连接载体：plasmid（primary）工具酶：限制性内切酶

连接酶

常见的基因工程载体载体：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的运载工具。根据来源：plasmid;phage;viral;BAC;YAC根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核生物表达载体根据与宿主的关系分：整合性载体、非整合性载体基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几种常见的载体。载体的基本结构单元：1.复制起点2.克隆位点3.筛选标记其他条件：4.适当大小5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。质粒(Plasmid)质粒是独立于于宿主细胞（（如细菌）染染色体之外的的可进行复制制和遗传的遗遗传单位-双双链闭合环状状超螺旋DNA分子。是一种环状状的双链DNA分子，大小从从1K-200Kb。通常质粒含有有某些染色体体没有的基因因，负责编码码某些功能蛋蛋白，这些功功能并不是细细菌生存所必必需的，但在在一定环境下下，可对细菌菌宿主的生存存有利。由质质粒产生的表表型包括对抗抗生素的抗性性（R因子）、产生生抗生素、降降解复杂有机机化合物、产产生大肠杆菌菌素（大肠杆杆菌素因子col）、肠毒素及限制制酶、修饰酶酶等。质粒存在于细细菌、放线菌菌、真菌以及及一些动植物物细胞中，在在细菌细胞中中最多。它们们复制时利用用宿主细胞复复制自身染色色体的同一组组酶系。质粒DNA的特征质粒复制依赖赖宿主细胞的的复制机器，，但可以独立立复制。（单拷贝或多多拷贝：紧密密型质粒和松松弛型质粒））严紧型：这些些质粒的复制制是在寄主细细胞严格控制制之下的，与与寄主细胞的的复制偶联同同步。所以，，往往在一个个细胞中只有有一份或几份份拷贝；松驰型：这些些质粒的复制制是在寄主细细胞的松弛控控制之下的，，每个细胞中中含有10-200份拷贝不相容质粒携携带复制子基基本相似，复复制系统也相相同，在复制制和分配到子子细胞的过程程中相互竞争争。质粒DNA所编码的基因因产物赋予细细菌某些性状状特征。质粒并非细菌菌生存所必不不可少的遗传传物质，可以以在细菌间转转移与丢失。。质粒可自行失失去或经人工工处理而消失失可有几种质粒粒同时共存在在于一个细菌菌内，但同群群质粒有不相相容性（同群群质粒具有同同源性，可以以产生相同的的阻遏蛋白，，故彼此间有有相互抑制作作用，不能共共存于同一细细胞）（四）人工构构建质粒的基基本元件启始复制子：：使质粒在宿宿主细胞中能能够复制抗性基因：用用于筛选阳性性克隆。多克隆位点：：插入外源基基因。对于表达载体体还需要启动动子、多聚A尾等.易于操作：包包括宿主、转转化（或转染染）、分离纯纯化、重组等等等。pBR322plasmid是一个克隆载载体，作为一一个克隆载体体最基本的要要求都具备：：复制起点:Ori克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI筛选标记:Ampr。T-vectorPCR产物亚克隆载载体T—Vector是一种高效克克隆PCR产物(TACloning)的专用载体，，由pUC18载体改建而成成的。在pUC18载体的多克隆隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间间插入了EcoRV识别位点，用用EcoRV进行酶切反应应后，再在两两侧的3‘端添加“T”而成。因大部部分耐热性DNA聚合酶反应时时都有在PCR产物的3’末端添加一个个“A”的特性,所以用本制品品可大大提高高PCR产物的连接、、克隆效率。。T-vector克隆PCR产物时用高效效连接液LigationSolutionI可以在极短的的时间内(30分钟～1小时)完成连接反应应，大大地方方便了实验操操作。用途克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物使用M13primers进行DNA测序。原核生物表达达载体Bacterialexpressionvector复制起点克隆位点筛选标记启动子﹡转录终止序列列﹡核糖体结和位位点：起始密密码子ATG和SD序列（翻译识识别）原核生物表达达载体的基本本结构单元包包括：真核生物表达达载体（mammalianexpressionvector)真核生物表达达载体的结构构单元复制起点（真真核和原核））克隆位点筛选标记(原核和真核标标记）增强子/启动子﹡PolyA﹡终止信号LocationofFeaturesPCMVIE:CMVIEenhancer:1-659

CMVIEpromoter:669-750Interveningsequence(IVS):890-1022T7RNApolymerasepromoter:1067-1085Multiplecloningsite:1085-1137T3RNApolymerasepromoter:1158-1137SV40fragmentcontainingpolyadenylationsignal:1167-1388f1originofreplication:1483-1938EGFPexpressioncassette:2002-3455SV40enhancer/earlypromoter:2002-2420EGFPstructuralgene:2449-3168

Kozakconsensustranslationinitiationsite:2442-2452Startcodon(ATG):2449-2451;Stopcodon:3166-3168

InsertionofValatposition2:2452-2454GFPmut1chromophoremutations(Phe-64toLeu;Ser-65toThr):2731-2735

His-231toLeumutation(A-->T):3143

Bovinegrowthhormone(BGH)genefragmentcontainingpolyadenylationsignal:3182-3455SV40originofreplication:2318Ampicillinresistance(b-lactamase)gene:3449-4709Startcodon(ATG):3849-3451Stopcodon(TAA):4707-4709噬菌体载体λ噬菌体(λphage)外源DNA：9~23kb常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环环状DNA，克隆容量：：40~50kbM13噬菌体λ噬菌体(λphage)特点：一种能能感染大肠杆杆菌的病毒，，野生型为双双链线状DNA分子，长度48.5kb,分子两端各有有一个12bp组成的粘性末末端,感染大肠杆菌菌后,线状DNA通过粘性末端端互补连接成成环,连接处称COS位点。1.本身有复制体体系;2.中间(J-N间)是λ生长非必需区区,可被其它外源源DNA取代;3.λDNA在体外可包装装成病毒颗粒粒,感染效率高;4.载体容量大,可装入大片段段外源DNA(20kb);5.可人工加入多多克隆位点;6.筛选容易——噬菌斑筛选;7.主要用于DNA文库构建.插入型载体——含单一的限制制性酶切位点点，可接受10kb以下的外源片片段，可用于于cDNA文库构建；取代型载体——含某一限制性性酶的两个切切点，可接受受20kb左右的外源片片段，可用于于基因组DNA文库构建。粘性质粒(cosmid)是一种人工改改造的载体,双链环状DNA，含有λDNA的cos区+质粒，克隆容容量：40~50kb1.λ-DNA的COS位点;

2.质粒的复制起起点和抗药性性标记(Ampr);

3.多种单一的酶酶切位点.cosmid较小,约4–6kb,可容纳40-45kb的外源DNA,由于噬菌体DNA包装时包装蛋蛋白识别的只只是DNA粘性末端附近近的一小段顺顺序，因此只只要一个质粒粒接上此粘性性末端顺序，，再加上外源源DNA片段使其长度度为野生型DNA大小的75－－105%，，重组体可象象噬菌体一样样进行外壳装装配,形成噬菌体颗颗粒,感染大肠杆菌菌效率比质粒粒高得多,进入宿主细胞胞后,只能象质粒一一样扩增,并依赖抗药性性被筛选.优缺点:

1.克隆效率高;

2.可利用质粒DNA的方式扩增;

3.可克隆较大DNA片段;主要用于真核核基因的克隆隆,基因组文库构构建4.缺点:产生串联现象象。M13噬菌体一一种丝状单单链噬菌体，，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载载体.最大优点：产产生单链DNA,可制备单链DNA探针.构建基因文库库的克隆载体体粘粒(Cosmid)细菌人工染色色体(BAC)酵母人工染色色体(YAC)P1噬菌体人工染染色体(PAC)P1及YAC载体酵母人工染色色体，可容纳纳外源基因片片段长达200kb-1000kb，含有酵母第第4号染色体的着着丝粒和自主主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的的Tel序列，选择性性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中中稳定的复制制，常用于大大的染色体基基因组DNA文库构建。一个典型的YAC系列载体病毒载体DNA病毒在细胞中中具有较高的的拷贝数，并并有较强的启启动子，因而而是基因工程程载体的理想想候选者。诸诸如：SV40（猴肾病毒））Epstein-Barr病毒(EBV病毒)牛乳头瘤病毒毒（BPV）昆虫杆状病毒毒（baculovirus)由于存在容量量小、宿主范范围小等缺陷陷，天然SV40病毒作为载体体很少被使用用，多数载体体为带有来自自SV40中转录元件的的质粒型载体体SV40增强子、启动动子和复制子子，可以在哺哺乳动物细胞胞中产生高效效的组成型表表达。SV40polyA信号，可以对对转录产物进进行加工，稳稳定转录产物物的活性。Zeocin抗性基因，可可作为大肠杆杆菌及哺乳动动物细胞的选选择标记。Zeocin抗性基因在大大肠杆菌中的的合成由EM-7启动子控制，，在哺乳动物物细胞中的表表达由CMV启动子控制，，既可用于瞬瞬时表达，也也可用于筛选选稳定表达的的细胞系。f1复制子，，可产生生单链DNA。。ColE1复制起始始位点，，使质粒粒可在大大肠杆菌菌中复制制扩增。。EB病毒EB病毒Epstein-Barr病毒(EBV病毒)是是人类疱疱疹病毒毒,可可转化人人的B淋巴细胞胞，在转转化细胞胞中以染染色体外外附加体体形式存存在。EBV病毒的顺顺式作用用因子oriP可以在带带有EBVDNA并表达具具有反式式作用的的EBNA－1抗原的贴贴壁细胞胞中维持持附加体体DNA分子的存存在，因因而能作作为构建建表达载载体的元元件，该该类载体体也主要要用于建建立带有有多拷贝贝外源基基因的细细胞系。。可在多多种细胞胞中表达达，可表表达基因因组DNA和cDNA,可为表达达细胞系系。ComparisonofdifferentcloningvectorsVectortypeLengthofclonedDNAPlasmid20kbPhageλ25kbCosmid45kbP1vector100kbBAC100Kb(bacterialartificialchromosome)YAC1,000kb(yeastartificialchromosome)DNA重组操作作过程载体外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞abbA重组Ab抗性筛选重组筛选一把特殊殊的剪刀刀—限制性内内切酶30多年前，，当人们们在对噬噬菌体的的宿主特特异性的的限制-修饰现象象进行研研究时，，首次发发现了限限制性内内切酶。。细菌可可以抵御御新病毒毒的入侵侵，而这这种“限制”病毒生存存的办法法则可归归功于细细胞内部部可摧毁毁外源DNA的限制性性内切酶酶。这些些酶可在在特定位位点切开开DNA，产生可可体外连连接的基基因片段段。研究究者很快快发现内内切酶是是研究基基因组成成、功能能及表达达非常有有用的工工具。阿尔伯(Arber)、史密斯斯(Smith)和内森斯斯(Nathans)，获1978年诺贝尔尔生理学学和医学学奖限制性内内切酶的的特点：：限制性内内切酶的的形式多多样，从从大小上上来说，，它们可可以小到到如PvuII（157个氨基酸酸），也也可以比比1250个氨基酸酸的CjeI更大除了某些些病毒以以外，限限制性内内切酶只只在原核核生物中中被发现现在已纯化化分类的的3000种限制性性内切酶酶中，已已发现了了超过250种的特异异识别序序列。限制性内内切酶的的命名限制性内内切酶命命名的次次序如下下：A用3个字母代代表来源源的生物物，如大大肠杆菌菌（Escherichiacoli）用Eco表示，流流感嗜血血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。B1个字母或或阿拉伯伯数字代代表菌株株（EcoR、Hind）C1个罗马字字母代表表发现或或鉴定的的次序（（EcoRI、HindIII）限制性内内切酶的的分类按照亚基基组成、、酶切位位置、识识别位点点、辅助助因子等等因素限限制性内内切酶可可划分为为三大类类：I型限制性性内切酶酶II型限制性性内切酶酶III型限制性性内切酶酶I型限制性性内切酶酶是一类类兼有限限制性内内切酶和和修饰酶酶活性的的多个亚亚基的蛋蛋白复合合体。其其特点是是识别位位点和切切割位点点不一致致，没有有固定切切割位点点。它们们在识别别位点很很远的地地方任意意切割DNA链，不产产生确定定的限制制片段和和明确的的电泳条条带，因因而不具具备实用用性。III型限制性性内切酶酶也是兼兼有限制制-修饰两种种功能的的酶。虽虽然有特特异切割割位点，，但它们们在识别别位点之之外切开开DNA链，很少少能产生生确定的的切割片片段，因因而不具具备实用用价值，，也没有有人将其其商业化化。II型限制性性内切酶酶在其识识别位点点之中或或临近的的确定位位点特异异地切开开DNA链。它们们产生确确定的限限制片段段和跑胶胶条带，，因此是是三种限制性内内切酶中中唯一用于于DNA分析和克克隆的一一类。II型限制性性内切酶酶由一群群性状和和来源都都不尽相相同的蛋蛋白组成成，因而而任意一一种限制制性内切切酶的氨氨基酸序序列可能能与另一一种限制制性内切切酶的氨氨基酸序序列截然然不同。。实际上上，从已已知的情情况上看看，这些些酶很可可能是在在进化过过程中各各自独立立产生的的，而非非来源于于同一个个祖先。。II型限制性内切切酶中最普遍遍的是象HhaI、HindIII和NotI这样在识别序序列中进行切切割的酶。这这一类酶是构构成商业化酶酶的主要部分分。大部分这类酶酶都以同二聚聚体的形式结结合到DNA上，因而识别别的是对称序序列；但有极极少的酶作为为单聚体结合合到DNA上，识别非对对称序列。一些酶识别连连续的序列（（如EcoRI识别GAATTC）；而另一些些识别不连续续的序列（如如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶的切割后产产生一个3‘羟基端和一个个5’磷酸基团。它它们的活性要要求镁离子的的存在，而相相应的修饰酶酶则需要S-甲硫氨酸腺苷苷的存在。这这些酶一般都都比较小，亚亚基一般都在在200-300个氨基酸左右右。一些概念粘末端和平末末端同尾酶同裂酶同识异切酶消化星号活力限制性核酸内内切酶作用后后产生两种末末端：钝性末端(bluntend)粘性末端(stickyend)同尾酶有时两种酶切切割序列不完全相同，但却能产生生相同的粘性末末端，这类酶被称称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类类末端连接起起来，但原来来的酶切位点点将被破坏，，有时可能会会产生一个新新的酶切位点点。如XbaⅠ(T`CTAGA)、NheⅠ(G`CTAGC）、SpeⅠ(A`CTAGT)切割的DNA序列不同，但但均给出相同同的“CTAG”粘性末端。这这些粘性末端端连接后，以以上的酶将不不能再切割，，但却产生了了一个新的4核苷酸的酶切切位点，即BfaⅠ（C`TAG)的酶切位点。。有时两种限制制性内切酶的的识别核苷酸顺序和和切割位置都都相同，其差别只在在于当识别顺顺序中有甲基基化的核苷酸酸时，一种限限制性内切酶酶可以切割，，另一种则不不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都都是5’……CCGG……3’，如果其中有有5’-甲基胞嘧啶，，则只有HpaⅡ能够切割。这这些有相同切切点的酶称为为同裂酶（同切切酶或异源同同工酶）。同裂酶限制性内切酶酶在非标准反反应条件下,也能切割一些些与其特异识识别序列类似似的序列。星号活性的识识别形式常对对标准识别顺顺序中两侧的的碱基没有特特异性。因此此,尽量采用规范范的实验步骤骤,应用推荐的反反应条件。星号活力克隆（有时与与甲基化酶联联用）鉴定（基因片片断大小、正正反向）检测突变（识识别位点，限限制酶切图谱谱的多态性RFLP）制作Marker限制性内切酶酶的应用限制性内切酶酶的使用一个标准的酶酶切反应包含含：DNA合适的酶缓冲冲液蛋白酶为了提高酶切切效率，可加加入BSA。1、建立一个标标准的酶切反反应通常，10个单位的内切切酶可以切割割1μg不同来源和纯纯度的DNA。一个50μl的反应体系中中，1μl的酶在1XBuffer终浓度及相应应温度条件下下反应1小时即可降解解1μg已纯化好的DNA。如果加入更更多的酶，则则可相应缩短短反应时间；；如果减少酶酶的用量，对对许多酶来说说，相应延长长反应时间（（不超过16小时）也可完完全反应。一般说来，线线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2单位的酶，而而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。应用中的注意意点2.选择正确的酶酶不言而喻，选选择的酶在底底物DNA上必须至少有有一个相应的的识别位点。。内切酶的产产物可以是粘粘端的（3'或5'突出端），也也可以是平端端的片段。粘粘端产物可以以与相容的其其它内切酶产产物连接，而而所有的平端端产物都可以以互相连接3、加酶内切酶一旦拿拿出冰箱后应应当立即置于于冰上。酶应应当是最后一一个被加入到到反应体系中中（在加入酶酶之前所有的的其它反应物物都应当已经经加好并已预预混合）。酶酶的用量视在在底物上的切切割频率而定定。4、DNA待切割的DNA应当已去除酚酚、氯仿、乙乙醇、EDTA、去污剂或过过多盐离子的的污染，以免免干扰酶的活活性。DNA的甲基化也应应该是酶切要要考虑到的因因素5、缓冲液对于每一种酶酶都提供相应应的最佳缓冲冲液，可保证证酶活性。使使用时的缓冲冲液浓度应为为1X。有的的酶要要求100μg/ml的BSA以实现现最佳佳活性性。不不需要要BSA的酶如如果加加了BSA也不会会受太太大影影响6、反反应体体积内切酶酶活力力单位位的定定义是是：1小时内内，50μμl反应体体积中中，降降解1μg的底物物DNA所需的的酶为为一个个活力力单位位。因因此酶酶：DNA的反应应比例例可以以由此此确定定。较较小的的反应应体积积更容容易受受到移移液器器误差差的影影响。。为了了将甘甘油的的浓度度控制制在5%以下，要要注意酶酶的体积积不要超超过总体体积的10%（一般酶酶都贮存存于50%的甘油中中）7、混合这是非常常重要然然而常常常被忽略略的一步步。想要要反应完完全，必必须使反反应液充充分混合合。我们们推荐用用枪反复复吸取混混合，或或是用手手指轻弹弹管壁混混合，然然后再快快速离心心一下即即可。注注意：不不可振荡荡！8、反应温温度大部分酶酶的反应应温度为为37℃；从嗜热热菌中分分离出来来的内切切酶则要要求更高高的温度度。一般般为50-65℃不等9、反应时时间1酶活单位位的定义义时间为为1小时。如如果加入入的酶较较多，可可以相应应地缩短短反应时时间；反反之，如如果加入入的酶量量较少，，也可以以延长时时间以使使反应达达到完全全10、终止反反应如果不进进行下一一步酶切切反应，，可用终终止液来来终止反反应。我我们使用用如下反反应终止止液：50%的甘油，，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（（10μl/50μl反应液））。如果果要进行行下一步步酶切反反应，可可用热失失活法终终止反应应（65℃或85℃，20分钟）。。热失活活并不能能适用于于所有的的酶。此此外，酚酚/氯仿抽提提也可以以用于终终止反应应。11、贮存大部分酶酶应贮存存于-20℃℃。少部分分酶则须须在-70℃℃长期保存存。10XBUFFER和100XBSA于-20℃℃保存。BSA不能与Buffer混合后保保存，否否则将会会出现BSA沉淀12、稳定性性大部分酶酶在推荐荐的保存存缓冲液液里在-20℃℃条件下十十分稳定定。高于于-20℃℃条件下稳稳定性将将有所降降低13、对照反反应如果发现现DNA底物不能能被成功功切开，，可以进进行对照照实验以以查明原原因。具具体方法法如下：：将不加内内切酶的的底物DNA（待切底底物）与与加入了了内切酶酶的对照照DNA（有多个个已知酶酶切位点点）同时时进行反反应。若若实验结结果表明明底物DNA降解，则则说明DNA在纯化过过程中或或反应液液里引入入了核酸酸酶污染染；若实实验结果果发现底底物DNA保持完整整，而对对照DNA被成功切切开，则则可以排排除酶质质量的原原因，此此时可以以将对照照DNA和待切底底物DNA混合起来来再次进进行反应应，以确确定样品品中是否否有抑制制剂。如如果有抑抑制剂存存在（通通常是盐盐、EDTA或酚），，则混合合物里的的对照DNA也无法被被切开使用限制制性内切切酶的一一般步骤骤A）测试酶酶切DNA的量B）计算完完全酶切切所需的的酶量。。为使终终体积中中甘油的的浓度低低于8%，计算能能加的酶酶量，最最多能加加终体积积的10%（甘油的的浓度为为5%）。C）10X反应液的的体积应应为终体体积的1/10；10X反应液的的体积不不应小于于酶的体体积。D）加入计计算好的的DNA，10X反应液，，酶。加入水到到终体积积（20-50ul），轻轻轻混匀，，在适当当的温度度下保温温。一般般酶的最最适温度度为37oC，但有例例外。应应查讯分分析说明明。举例质粒DNA（2ug/ul）5ul10X反应液5ul内切酶2uldH2O38ul总体积50ul37oC保温2-3小时。应最后加加酶。提高限制制性核酸酸内切酶酶对低纯纯度DNA制剂的反反应效率率，可采采用的方方法增加限制制性核酸酸内切酶酶的用量量，平均均每微克克底物DNA可高达10个活性单单位甚至至更多些些。扩大酶催催化反应应的体积积，使潜潜在的抑抑制因素素被相应应的稀释释。延长酶催催化反应应的保温温时间。。能否在一一次反应应中用很很多的限限制性内内切酶？？可以，一一般而言言，甘油油浓度超超过8%对酶切有有抑制。。有些酶酶在高的的甘油浓浓度中会会产生星星号活力力。限制制性内切切酶提供供在50%的甘油中中，故10ul反应体积积中不应应加入超超过1.6ul的酶。6.双酶切：：根据重组组的需要要，有时时需要用用双酶切切（单酶酶切：由由于只有有一种酶酶切，载载体片段段很容易易相互粘粘连，形形成空载载体），，这样重重组效果果会更好好。双酶切时时要先分分析两种种酶且的的条件，，根据两两种酶切切的缓冲冲液要求求，有三三种情况况兼容性

处理完全兼容同时加2种酶进行酶切完全不兼容先用一种酶切，沉淀洗盐，再用另一种酶切相对兼容（其中一种酶活性相对较低）同时加2种酶进行酶切只是盐离子浓度不同先用低离子要求的酶切，再补加酶和盐。7.载体的酶酶切：酶切条件件与外源源DNA没有区别别。载体体多位环环状DNA,如果只有有一个酶酶切位点点，用单单酶切。。目前商商业化载载体均有有多克隆隆位点，，含有多多个酶切切位点，，可以进进行多种种选择和和取舍。。酶切产物物回收离心柱回回收纯化化酶切产产物DNA片段纯化问题题：纯化化PCR产物割胶胶还是柱柱式，推推荐柱式式，因为为割胶手手法不准准，很容容易割下下大块的的胶，影影响纯化化效率。。现在的的柱式纯纯化号称称可以祛祛除引物物，既然然如此，，酶切掉掉的几个个碱基肯肯定也会会被纯化化掉了。。所以，，PCR产物和双双酶切产产物的纯纯化均可可应用柱柱式纯化化。数据库限制性内内切酶的的数据库库/rebase其中含有有已知的的所有限限制性内内切酶的的完整表表，包括括识别的的序列，，甲基化化的敏感感性，商商业信息息和参考考文献。。Company:TAKARAFermentas连接酶（（ligase)主要有两两种：T4噬菌体DNA连接酶和和大肠杆杆菌DNA连接酶。。催化相相邻DNA链的5’-P和3’-OH末端以磷酸酸二酯键结结合。E.coliDNA连接酶催化