电针不同频率对阿尔茨海默病大鼠海马突触传递功能影响研究课件

电针不同频率对阿尔茨海默病大鼠海马突触传递功能影响研究

电针不同频率对阿尔茨海默病大鼠海马突触传递功能影响研究

课题来源

电针不同频率调控糖原合酶激酶3

β对阿尔茨海默病大鼠神经突触可塑性影响及机制研究

（国家自然科学基金面上项目）课题来源报告内容

4123研究内容技术路线可行性分析目的意义立项依据研究方法预期结果研究进度报告内容4123研究内容技术路线可行性分析目的意义目的意义

阿尔茨海默病((Alzheimer.sdisease,AD)又称老年痴呆是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，以老年斑(SP)，神经元纤维缠结(NFT)和神经元丢失为主要病理改变。

目前全世界有2600万人患AD，65岁以上的人AD的发病率为8.4%，我国老年痴呆患者约占世界的四分之一，达600万-700万人，发病率正以每年1.4%的速度上升,为威胁我国老年健康的主要疾病之一

临床研究表明,针灸治疗AD安全、有效,在治疗效果和总有效率方面较药物具有优势。本实验以益肾调督为治则，选取百会和肾腧穴，借助神经电生理学检测来观察不同频率电针对神经突触可塑性的影响，从而研究针灸延缓衰老、防治AD的作用机制，为临床治疗AD提供新的实验依据。目的意义阿尔茨海默病((Alzheimer.s立题依据AD病因及防治是一个非常复杂的问题,现代医学对它的研究已深入到基因、分子水平，但仍不能揭示其确切的病因和发病机制。学习记忆障碍是AD的主要临床表现,而神经突触可塑性被认为是学习与记忆的重要细胞学基础。

突触是两个神经元间高度局限性、特异性的连接位点.在此点神经递质由一个突触前神经元轴突终末释放，激活突触后神经元上受体完成信息传递，突触是神经传输、加工的枢纽，是受体、通道、蛋白的密集之地其变化是学习记忆形成的一个重要的形态学和功能学基础突触的丧失会中断许多功能通路的联系，引起多方面的功能障碍，尤其是严重的认知和记忆功能障碍从而导致痴呆立题依据AD病因及防治是一个非常复杂的问题,立题依据

突触可塑性包括结构和功能两方面,突触形态结构的可塑性表现为突触活性区数量与面积的改变、突触间隙的变化以及各种亚细胞结构的改变等;突触功能的可塑性主要表现为突触传递功能的增强或减弱，而对机体活动造成直接影响的是突触(信息传递)功能的可塑性。

长时程增强

(long-termpotentiation,LTP)和长时程抑制(long-termdepression,LTD)是表示突触传递功能的两个重要电生理指标,也是可塑性的重要表现形式，LTP作为突触可塑性的实验模型已经被神经科学家们广泛地用于学习和记忆的研究中，现一般认为,LTP和LTD均为某些学习记忆活动的细胞水平的神经生物学基础,LTP与记忆的形成和储存有关,而LTD与记忆的整合、遗忘和恢复突触产生LTP的能力(去饱和)等有关,两者共同组成一个能学习的神经网络突触可塑性（LTP、LTD）学习记忆AD立题依据突触可塑性包括结构和功能两方面,突触形立题依据AD病，在中医学中，属于神志病，病变在脑，肾为先天之本，藏精，主骨生髓，上通于脑,脑为元神之府，脑和神明有赖于髓之荣养,肾精充足则脑髓充足，脑髓充足则神自旺,老年痴呆皆因至肾亏之年，肾气已衰，精髓乏源，脑失所养，再加其他因素诱发而成。

百会位居头之巅顶，又名三阳五会，是督脉与足太阳、手太阳、足少阳、足厥阴等经脉交会处，具有安神、补脑益智之功，是治疗脑病的首选穴位。

针刺“百会”不但可以激发局部头部经气治疗脑病，还可以激发诸经经气治疗十四经病，使机体阴阳平衡，气血调和

肾腧穴位于背部属于足太阳膀胱经，足太阳膀胱经与足少阴肾经为表里经，加上肾腧穴是肾的背腧穴，因此刺激肾腧穴可以起到调节肾经，滋补肾精的作用

由此可见，百会及肾俞二穴同用，可起到益肾调督，延缓脑生理老化，从而达到防治AD的目的。立题依据AD病，在中医学中，属于神志病研究内容观察各组大鼠行为学的改变观察AD模型大鼠海马神经突触传递功能电生理LTP和LTD的改变与学习记忆的关系电针不同频率对AD模型大鼠神经元突触可塑性的影响及与学习记忆的关系研究内容观察各组大鼠行为学的改变观察AD模型大鼠海马神经突触研究方法

4123实验动物及分组主要实验器材和药品动物模型制备方法动物取材5诱发电位的记录研究方法4123实验动物及分组主要实验器材和药品动物模选用SPF级健康wistar雄性大鼠,3-4月龄,由湖北省实验动物研究中心提供（许可证号：SCXK（鄂）

2008-0005）。大鼠适应性喂养，正常饮食，饮水，7天后进行Morris水迷宫测试，剔除不合格者（即反应过于迟钝或灵敏者），保留合格大鼠50只，随机分为正常组、模型组、假手术组、2Hz电针治疗组、50Hz电针治疗组，共5组，每组10只实验动物及分组选用SPF级健康wistar雄性大鼠,3-4月龄,由湖北省实

（1）正常组：与其他治疗组用同样的方法进行抓取，但不予任何处理。

（2）模型组：即脑室内注射Aβ1-42建立AD大鼠模型(具体方法见下文)。造模成功后，不进行任何治疗。与其他治疗组用同样的方法进行抓取。

（3）假手术组：制作方法同模型组，仅注射相同量的生理盐水。与其他治疗组用同样的方法进行抓取。

（4）2Hz电针治疗组：即在成功造模后立即开始施于电针刺激。针刺大鼠“百会”（顶骨正中）、“肾俞”（第二腰椎下两旁）穴(穴位定位参照中国针灸学会实验针灸分会制定的《动物针灸穴位图谱》)，百会向前平刺3-5mm，肾俞穴稍向内斜刺5mm，接上海产G6805Ⅱ型电针治疗仪，百会接负极，肾俞接正极，左右侧肾俞每日交替使用。选用连续被，频率2Hz，电压2-4V，电流1-2mA，留针20min，每日1次，7日为1疗程，疗程间休息1日，共治疗2个疗程。

（5）50Hz电针治疗组：电针选用连续波，频率50Hz，电压、电流、操作方法同2Hz电针治疗

组。（1）正常组：与其他治疗组用同样的方法进行抓取，但不予任何主要实验器材大鼠脑立体定位仪电针治疗仪主要实验器材大鼠脑立体定位仪电针治疗仪主要实验器材膜片钳系统Morris水迷宫测试系统主要实验器材膜片钳系统Morris水迷宫测试系统主要实验试剂试剂厂家Aβ1-42注射液Sigma青霉素国药集团生理盐水国药集团4%多聚甲醛国药集团10%水合氯醛国药集团主要实验试剂试剂厂家Aβ1-42注射液Sigma青霉素国药集

实验前将Aβ1-42用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成１ug/μl的溶液３７℃孵育7d，使其变成聚合状态从而具有神经毒性；实验用大鼠置于安静清洁环境中，分笼喂养，温度控制在（２４±２）℃，定时给予充足清洁饮水和定量大鼠专用饲料。适应性喂养１周后，无不良反应，饮食、饮水正常者，开始进行Morris水迷宫测试筛选，剔除不符合评定标准的大鼠动物模型制备方法实验前将Aβ1-42用磷酸盐缓冲液（PBS）评定后的合格大鼠进行称重，用10%的水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上保持前后囟在同一水平。无菌环境下，颅顶区备皮，剥开皮下筋膜暴露顶骨，进行手术区皮肤消毒，于两侧冠状缝后钻出小孔，取出碎骨屑，保持硬脑膜的完整。按照“大鼠脑立体定位图谱”选择大鼠海马区域用微量注射器缓慢将药物Aβ1-42（10μl）注入海马（前囟后3.3mm，中线左右各旁开1.5mm，深度3mm），5min内注完，注射后留针5min，按1.0mm/min的速度缓慢出针，以免拔针时药物溢出。术后牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤，３日内每日肌内注射青霉素Ｇ10万Ｕ防止感染，并经Morris水迷宫进行模型评价，剔除不合格者。动物模型制备方法评定后的合格大鼠进行称重，用10%的水合氯醛（300mg/k

动物取材

1、大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉(0.4ml/100g)下断头

在以

95%O2+5%CO2

混合气饱和的

4℃人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)持续冲洗下,迅速取脑并置于预先用

ACSF湿润的滤纸上,沿正中线切开两大脑半球。2、

由脑腹内侧沿皮层边缘仔细分离出海马,在通有混合气的4℃ACSF中,用切片刀垂直于海马长轴将其切成厚约400um的脑薄片,所有脑片置于

30～32℃ACSF中,并不断通入

95%O2+5%CO2混合气,孵育

1～2h待用。3、ACSF的成分为(mmol/L):NaCl124,KCl5.0,NaH2PO41.25,MgSO42.0,CaCl22.5,NaHCO322.0和葡萄糖

10.0。动物取材诱发电位记录

1、LTP(或

LTD)中突触可塑性改变程度用

HFS(或LFS)后

PS幅值与条件刺激

PS幅值均值之比表示。

2、取一个脑片置于记录小室内,将双极钨丝电极置于

Schaffer侧支通路,以内充

ACSF的两根玻璃微电极(阻抗

5～15MΩ)分别置于

CA1区的辐射层和锥体细胞层,细胞外记录群体峰电位（PS）,PS的幅值用第一个下降相最低点到两个上升波峰连线中点距离来度量。

RecordingelectrodeRecordingelectrode诱发电位记录1、LTP(技术路线技术路线预期结果1234电针对AD模型大鼠海马神经元突触传递功能存在影响圆满完成实验大鼠海马部位注射Aβ1-42成功复制出AD模型电针不同频率对AD模型大鼠海马神经元突触传递功能的影响不同5预期结果1234电针对AD模型大鼠海马神经元突触传递功能存在可行性分析

1.本课题立题依据可靠，目的明确。2.所选穴位合理。3.本课题所选择AD模型是研究阿尔茨海默病的常用模型。4.整个实验过程和操作熟练掌握，实验在针灸重点科学实验室进行，拥有先进膜片钳系统，并有长期从事相关研究的专家教授亲自指导。5.实验指标LTP、LTD等已有相关研究可行性分析

研究进度安排时间内容2013年10月——2014年2月采购实验大鼠，所需试剂，准备实验所需器材。2014年3月——2014年5月模型制备，取材等2014年6月——2014年9月实验结果及数据分析，准备开题报告及论文。研究进度安排时间内容20ThankYou!ThankYou!

电针不同频率对阿尔茨海默病大鼠海马突触传递功能影响研究

电针不同频率对阿尔茨海默病大鼠海马突触传递功能影响研究

课题来源

电针不同频率调控糖原合酶激酶3

β对阿尔茨海默病大鼠神经突触可塑性影响及机制研究

（国家自然科学基金面上项目）课题来源报告内容

4123研究内容技术路线可行性分析目的意义立项依据研究方法预期结果研究进度报告内容4123研究内容技术路线可行性分析目的意义目的意义

阿尔茨海默病((Alzheimer.sdisease,AD)又称老年痴呆是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，以老年斑(SP)，神经元纤维缠结(NFT)和神经元丢失为主要病理改变。

目前全世界有2600万人患AD，65岁以上的人AD的发病率为8.4%，我国老年痴呆患者约占世界的四分之一，达600万-700万人，发病率正以每年1.4%的速度上升,为威胁我国老年健康的主要疾病之一

临床研究表明,针灸治疗AD安全、有效,在治疗效果和总有效率方面较药物具有优势。本实验以益肾调督为治则，选取百会和肾腧穴，借助神经电生理学检测来观察不同频率电针对神经突触可塑性的影响，从而研究针灸延缓衰老、防治AD的作用机制，为临床治疗AD提供新的实验依据。目的意义阿尔茨海默病((Alzheimer.s立题依据AD病因及防治是一个非常复杂的问题,现代医学对它的研究已深入到基因、分子水平，但仍不能揭示其确切的病因和发病机制。学习记忆障碍是AD的主要临床表现,而神经突触可塑性被认为是学习与记忆的重要细胞学基础。

突触是两个神经元间高度局限性、特异性的连接位点.在此点神经递质由一个突触前神经元轴突终末释放，激活突触后神经元上受体完成信息传递，突触是神经传输、加工的枢纽，是受体、通道、蛋白的密集之地其变化是学习记忆形成的一个重要的形态学和功能学基础突触的丧失会中断许多功能通路的联系，引起多方面的功能障碍，尤其是严重的认知和记忆功能障碍从而导致痴呆立题依据AD病因及防治是一个非常复杂的问题,立题依据

突触可塑性包括结构和功能两方面,突触形态结构的可塑性表现为突触活性区数量与面积的改变、突触间隙的变化以及各种亚细胞结构的改变等;突触功能的可塑性主要表现为突触传递功能的增强或减弱，而对机体活动造成直接影响的是突触(信息传递)功能的可塑性。

长时程增强

(long-termpotentiation,LTP)和长时程抑制(long-termdepression,LTD)是表示突触传递功能的两个重要电生理指标,也是可塑性的重要表现形式，LTP作为突触可塑性的实验模型已经被神经科学家们广泛地用于学习和记忆的研究中，现一般认为,LTP和LTD均为某些学习记忆活动的细胞水平的神经生物学基础,LTP与记忆的形成和储存有关,而LTD与记忆的整合、遗忘和恢复突触产生LTP的能力(去饱和)等有关,两者共同组成一个能学习的神经网络突触可塑性（LTP、LTD）学习记忆AD立题依据突触可塑性包括结构和功能两方面,突触形立题依据AD病，在中医学中，属于神志病，病变在脑，肾为先天之本，藏精，主骨生髓，上通于脑,脑为元神之府，脑和神明有赖于髓之荣养,肾精充足则脑髓充足，脑髓充足则神自旺,老年痴呆皆因至肾亏之年，肾气已衰，精髓乏源，脑失所养，再加其他因素诱发而成。

百会位居头之巅顶，又名三阳五会，是督脉与足太阳、手太阳、足少阳、足厥阴等经脉交会处，具有安神、补脑益智之功，是治疗脑病的首选穴位。

针刺“百会”不但可以激发局部头部经气治疗脑病，还可以激发诸经经气治疗十四经病，使机体阴阳平衡，气血调和

肾腧穴位于背部属于足太阳膀胱经，足太阳膀胱经与足少阴肾经为表里经，加上肾腧穴是肾的背腧穴，因此刺激肾腧穴可以起到调节肾经，滋补肾精的作用

由此可见，百会及肾俞二穴同用，可起到益肾调督，延缓脑生理老化，从而达到防治AD的目的。立题依据AD病，在中医学中，属于神志病研究内容观察各组大鼠行为学的改变观察AD模型大鼠海马神经突触传递功能电生理LTP和LTD的改变与学习记忆的关系电针不同频率对AD模型大鼠神经元突触可塑性的影响及与学习记忆的关系研究内容观察各组大鼠行为学的改变观察AD模型大鼠海马神经突触研究方法

4123实验动物及分组主要实验器材和药品动物模型制备方法动物取材5诱发电位的记录研究方法4123实验动物及分组主要实验器材和药品动物模选用SPF级健康wistar雄性大鼠,3-4月龄,由湖北省实验动物研究中心提供（许可证号：SCXK（鄂）

2008-0005）。大鼠适应性喂养，正常饮食，饮水，7天后进行Morris水迷宫测试，剔除不合格者（即反应过于迟钝或灵敏者），保留合格大鼠50只，随机分为正常组、模型组、假手术组、2Hz电针治疗组、50Hz电针治疗组，共5组，每组10只实验动物及分组选用SPF级健康wistar雄性大鼠,3-4月龄,由湖北省实

（1）正常组：与其他治疗组用同样的方法进行抓取，但不予任何处理。

（2）模型组：即脑室内注射Aβ1-42建立AD大鼠模型(具体方法见下文)。造模成功后，不进行任何治疗。与其他治疗组用同样的方法进行抓取。

（3）假手术组：制作方法同模型组，仅注射相同量的生理盐水。与其他治疗组用同样的方法进行抓取。

（4）2Hz电针治疗组：即在成功造模后立即开始施于电针刺激。针刺大鼠“百会”（顶骨正中）、“肾俞”（第二腰椎下两旁）穴(穴位定位参照中国针灸学会实验针灸分会制定的《动物针灸穴位图谱》)，百会向前平刺3-5mm，肾俞穴稍向内斜刺5mm，接上海产G6805Ⅱ型电针治疗仪，百会接负极，肾俞接正极，左右侧肾俞每日交替使用。选用连续被，频率2Hz，电压2-4V，电流1-2mA，留针20min，每日1次，7日为1疗程，疗程间休息1日，共治疗2个疗程。

（5）50Hz电针治疗组：电针选用连续波，频率50Hz，电压、电流、操作方法同2Hz电针治疗

组。（1）正常组：与其他治疗组用同样的方法进行抓取，但不予任何主要实验器材大鼠脑立体定位仪电针治疗仪主要实验器材大鼠脑立体定位仪电针治疗仪主要实验器材膜片钳系统Morris水迷宫测试系统主要实验器材膜片钳系统Morris水迷宫测试系统主要实验试剂试剂厂家Aβ1-42注射液Sigma青霉素国药集团生理盐水国药集团4%多聚甲醛国药集团10%水合氯醛国药集团主要实验试剂试剂厂家Aβ1-42注射液Sigma青霉素国药集

实验前将Aβ1-42用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成１ug/μl的溶液３７℃孵育7d，使其变成聚合状态从而具有神经毒性；实验用大鼠置于安静清洁环境中，分笼喂养，温度控制在（２４±２）℃，定时给予充足清洁饮水和定量大鼠专用饲料。适应性喂养１周后，无不良反应，饮食、饮水正常者，开始进行Morris水迷宫测试筛选，剔除不符合评定标准的大鼠动物模型制备方法实验前将Aβ1-42用磷酸盐缓冲液（PBS）评定后的合格大鼠进行称重，用10%的水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上保持前后囟在同一水平。无菌环境下，颅顶区备皮，剥开皮下筋膜暴露顶骨，进行手术区皮肤消毒，于两侧冠状缝后钻出小孔，取出碎骨屑，保持硬脑膜的完整。按照“大鼠脑立体定位图谱”选择大鼠海马区域用微量注射器缓慢将药物Aβ1-42（10μl）注入海马（前囟后3.3mm，中线左右各旁开1.5mm，深度3mm），5min内注完，注射后留针5min，按1.0mm/min的速度缓慢出针，以免拔针时药物溢出。术后牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤，３日内每日肌内注射青霉素Ｇ10万Ｕ防止感染，并经Morris水迷宫进行模型评价，剔除不合格者。动物模型制备方法评定后的合格大鼠进行称重，用10%的水合氯醛（300mg/k

动物取材

1、大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉(0.4ml/100g)下断头

在以

95%O2+5%CO2

混合气饱和的

4℃人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)持续冲洗下,迅速取脑并置于预先用

ACSF湿润的滤纸上,沿正中线切开两大脑半球。2、

由脑腹内侧沿皮层边缘仔细分离出海马,在通有混合气的4℃ACSF中,用切片刀垂直于海马长轴将其切成厚约400um的脑薄片,所有脑片置于

30～32℃ACSF中,并不断通入

95%O2+5%CO2混合气,孵育

1～2h待用。3