微生物检验的基本操作技术课件

第六章微生物检验的基本操作技术第六章微生物检验的基本操作技术1第一节无菌操作一、无菌操作技术1、定义

是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。第一节无菌操作一、无菌操作技术22、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。2、内容31）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；3.无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时44）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，5二、无菌操作的环境要求无菌室超净工作台无菌器材二、无菌操作的环境要求无菌室61、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）；每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）；每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；7（3）无菌室使用要求无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。（3）无菌室使用要求无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤8

2、超净工作台超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作10－15分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.3.无菌器材（1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；（2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。

2、超净工作台9。（3）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上只允许摆放以下物品：

物品数量物品数量酒精灯1个灭菌平皿10块打火机1个试管架2副接种针1个灭菌吸管根据需要消毒棉球1瓶电子称1台洗耳球1个250ml灭菌三角瓶2个镊子1个培养基根据需要油性笔1支混匀器1台。物品数量物品数量酒精灯1个灭菌平皿10块打火机1个10三、无菌操作的基本技术1、无菌接种操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。三、无菌操作的基本技术1、无菌接种操作11无菌操作技术无菌操作技术12无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞无菌操作斜面接种时的无菌操作132、微生物检验过程中的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放；（3）、在正火焰上方操作；（4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）、在接种培养物时，协作应轻、准；（6）、不能用嘴直接吸吹吸管；（7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

2、微生物检验过程中的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅143、无菌操作技术详细图解（1）取菌技巧（2）接种技巧（3）错误示范（4）注意事项3、无菌操作技术详细图解（1）取菌技巧15接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次）（1）取菌技巧A接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火162.试管前端过火3.打打试管盖（1）取菌技巧A2.试管前端过火3.打打试管盖（1）取菌技巧A174.试管斜倾，放入接种环（1）取菌技巧A4.试管斜倾，放入接种环（1）取菌技巧A185.试管前端过火，盖上試管盖6.接种环烧红灭菌（1）取菌技巧A5.试管前端过火，盖上試管盖6.接种环烧红灭菌（1）取菌192.自平板上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入)1.(方法二：平板反面拿起)（1）取菌技巧B2.自平板上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，201.挤出安全吸球內空气，插上灭过菌之玻璃吸管2.向上为吸，向下为放（1）取菌技巧C1.挤出安全吸球內空气，插上灭过菌之玻璃吸管2.向上为吸211.调整Pipetman刻度(P1000吸取范围200~1000μl)2.插上灭过菌之Tip(用力插紧)（1）取菌技巧D1.调整Pipetman刻度(P1000吸取范围223.按钮压至第一段(不可压至最底)4.深入液面下2~4mm（1）取菌技巧D3.按钮压至第一段(不可压至最底)4.深入液面下2235.慢慢释放按钮，即可吸取液体（1）取菌技巧D5.慢慢释放按钮，即可吸取液体（1）取菌技巧D241.试管前端过火2.打开试管盖（2）接种技巧1.试管前端过火2.打开试管盖（2）接种技巧25方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以Pipetman吸取菌液，按钮压至最底排出菌液方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液（2）接种技巧方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以Pipe26操作時离火源遥远试管直放，空气中菌体容易掉入（3）错误示范操作時离火源遥远试管直放，空气中菌体容易掉入（3）错误示范27（3）错误示范安全吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球随意放置桌面，菌液容易流出至桌上（3）错误示范安全吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球随意放28（3）错误示范Pipetman倒放，菌液容易流入Pipetman內（3）错误示范Pipetman倒放，菌液容易流入Pipe29第二节、微生物的接种、分离纯化和培养技术第二节、微生物的接种、分离纯化和培养技术30一、接种1、接种定义接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种；2、接种工具在实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀一、接种1、接种定义1．接种针2.接种环3.接种钩4.31划线接种法斜面接种法涂布接种法液体接种法半固体穿刺接种法

3、微生物检验常见接种方法划线接种法32图4-2平板划线分离法

1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法

1）、平板划线分离法图4-2平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法33平板划线分离法--分区划线分离法（1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3……区依次划线；（2)每划完一个区域，转动培养皿约70度角，并将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域；（3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1～2次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落；（4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。平板划线分离法--分区划线分离法（1)用接种环先将培养物涂布34微生物检验的基本操作技术课件352）、斜面接种法

主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。以菌种移种为例，其接种方法是：（1）取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培养基管位于内侧；（2）右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接种环；（3）以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次；2）、斜面接种法主要用于经划线分离培养所获得的36斜面接种操作斜37（4）将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端；（5）取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好；（6）做好标识，置35℃培养箱中培养18~24小时。斜面培养一般形成均匀一致的菌苔。一般可观察表面、透明度、色泽等特征。（4）将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸38大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面大肠杆菌斜面393）稀释涂布分离法：用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，然后分别倒置于37℃温箱中培养。3）稀释涂布分离法：用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀404）、液体接种法（肉汤接种）（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管；（2）灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以18~24小时培养后观察生长特征。肉汤培养可观察如下几项：a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛；b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、有颗粒、絮状生长；c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）；d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、颗粒、皱状）；e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察是否产酸和有无气体。

4）、液体接种法（肉汤接种）（1）如斜面接种法持好菌种管及培415）、穿刺接种法（半固体接种）

多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌的某些生化反应。（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管；（2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出；（3）经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细菌有动力。5）、穿刺接种法（半固体接种）多用于保存42液体接种半固体穿刺营养肉汤：液体变混浊半固体琼脂培养基（0.5%）：扩散生长液体接种半固体穿刺营养肉汤：液体变混浊半固体琼脂培养基（0.43二、分离纯化1、几个定义混和培养物：含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）；纯培养：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）；分离纯化：在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物，得到纯培养的过程称为分离纯化。包括倾注平板法、涂布平板法、平板划线法等等。二、分离纯化1、几个定义44

将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，然后分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，待凝固之后，把这平板倒置在恒温培养箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。整个操作过程应严格按照无菌操作。2、倾注平板法（倒平板）将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，然后分别倒45倒平板技术倒平板技术46三、微生物的培养方法微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。通常分为：一般培养法（需氧培养）厌氧培养法CO2培养法三、微生物的培养方法微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外471、一般培养法（需氧培养）培养温度:25~37℃2、厌氧培养方法（1）简易的厌氧培养法：A、庖肉培养法B、铁丝圈厌氧培养法C、焦性没食子酸法（2）厌氧罐法（3）厌氧手套箱法1、一般培养法（需氧培养）48厌氧缸法厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。厌氧缸法49微生物检验的基本操作技术课件50厌氧手套箱厌氧手套箱513、二氧化碳培养法1）烛缸法2）二氧化碳置换法3）化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入。4）二氧化碳培养箱法3、二氧化碳培养法1）烛缸法52二氧化碳培养法烛缸法化学法二氧化碳培养法烛缸法化学法53二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱54四、微生物常规鉴定技术

1、形态结构和培养特性观察1）、在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；2）、在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等；3）、半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。四、微生物常规鉴定技术1、形态结构和培养特性观察551.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.纺锤状7.扁平8.隆起9.凸起10.垫状11.脐状12.边缘整齐13.波状14.裂片状15.啮蚀状16.丝状17.卷发状18.丝线状19.刺毛状20.串珠状21.疏展状22.树根状23.假根状24.丝状25.串珠状26.乳头状27.绒毛状28.树根状29.量杯状30.萝卜状31.漏斗状32.囊状33.层状34.絮状35.环状36.蹼状37.膜状1.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.56细菌各种菌落形态细菌各种菌落形态572、染色镜检1）染色原理由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,必须进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。2、染色镜检1）染色原理582）、染色方法①简单染色法简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。②复染色法用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。微生物检验的基本操作技术课件593）、革兰氏染色法

①、原理革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。

1884年由丹麦医师Gram创立。

染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G―表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。3）、革兰氏染色法

①、原理60②细菌的革兰氏染色步骤

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察A）取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同；B）用草酸铵结晶紫染色1min后水洗；C）加碘液媒染1min后水洗；D）斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20～30s，随即水洗；E）用蕃红染液复染30s，水洗；F）用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。微生物检验的基本操作技术课件61革兰氏染色图解革兰氏染色试剂

革兰氏染色图解革兰氏染色试剂62步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上

步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上

步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上步骤2：63步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层

步骤4：风干

步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层步骤4：风干64步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定步骤6：结晶紫染色1分钟

步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定步骤6：结65步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片

步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗

步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再66步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗

步骤10：番红复染30秒，用蒸馏水轻轻冲洗

步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗步骤10：67大肠杆菌金黄色葡萄球菌染色后镜检，油镜下的G-和G+大肠杆菌金黄色葡萄球菌染色后镜检，油镜下的G-和G+6812/23/2022693、生化鉴定试验

4、血清学试验12/17/2022693、生化鉴定试验

4、血清学试验69第六章微生物检验的基本操作技术第六章微生物检验的基本操作技术70第一节无菌操作一、无菌操作技术1、定义

是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。第一节无菌操作一、无菌操作技术712、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。2、内容721）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；3.无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时734）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，74二、无菌操作的环境要求无菌室超净工作台无菌器材二、无菌操作的环境要求无菌室751、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）；每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）；每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；76（3）无菌室使用要求无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。（3）无菌室使用要求无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤77

2、超净工作台超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作10－15分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.3.无菌器材（1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；（2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。

2、超净工作台78。（3）无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上只允许摆放以下物品：

物品数量物品数量酒精灯1个灭菌平皿10块打火机1个试管架2副接种针1个灭菌吸管根据需要消毒棉球1瓶电子称1台洗耳球1个250ml灭菌三角瓶2个镊子1个培养基根据需要油性笔1支混匀器1台。物品数量物品数量酒精灯1个灭菌平皿10块打火机1个79三、无菌操作的基本技术1、无菌接种操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。三、无菌操作的基本技术1、无菌接种操作80无菌操作技术无菌操作技术81无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞无菌操作斜面接种时的无菌操作822、微生物检验过程中的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放；（3）、在正火焰上方操作；（4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）、在接种培养物时，协作应轻、准；（6）、不能用嘴直接吸吹吸管；（7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

2、微生物检验过程中的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅833、无菌操作技术详细图解（1）取菌技巧（2）接种技巧（3）错误示范（4）注意事项3、无菌操作技术详细图解（1）取菌技巧84接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次）（1）取菌技巧A接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火852.试管前端过火3.打打试管盖（1）取菌技巧A2.试管前端过火3.打打试管盖（1）取菌技巧A864.试管斜倾，放入接种环（1）取菌技巧A4.试管斜倾，放入接种环（1）取菌技巧A875.试管前端过火，盖上試管盖6.接种环烧红灭菌（1）取菌技巧A5.试管前端过火，盖上試管盖6.接种环烧红灭菌（1）取菌882.自平板上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入)1.(方法二：平板反面拿起)（1）取菌技巧B2.自平板上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，891.挤出安全吸球內空气，插上灭过菌之玻璃吸管2.向上为吸，向下为放（1）取菌技巧C1.挤出安全吸球內空气，插上灭过菌之玻璃吸管2.向上为吸901.调整Pipetman刻度(P1000吸取范围200~1000μl)2.插上灭过菌之Tip(用力插紧)（1）取菌技巧D1.调整Pipetman刻度(P1000吸取范围913.按钮压至第一段(不可压至最底)4.深入液面下2~4mm（1）取菌技巧D3.按钮压至第一段(不可压至最底)4.深入液面下2925.慢慢释放按钮，即可吸取液体（1）取菌技巧D5.慢慢释放按钮，即可吸取液体（1）取菌技巧D931.试管前端过火2.打开试管盖（2）接种技巧1.试管前端过火2.打开试管盖（2）接种技巧94方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以Pipetman吸取菌液，按钮压至最底排出菌液方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液（2）接种技巧方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以Pipe95操作時离火源遥远试管直放，空气中菌体容易掉入（3）错误示范操作時离火源遥远试管直放，空气中菌体容易掉入（3）错误示范96（3）错误示范安全吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球随意放置桌面，菌液容易流出至桌上（3）错误示范安全吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球随意放97（3）错误示范Pipetman倒放，菌液容易流入Pipetman內（3）错误示范Pipetman倒放，菌液容易流入Pipe98第二节、微生物的接种、分离纯化和培养技术第二节、微生物的接种、分离纯化和培养技术99一、接种1、接种定义接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种；2、接种工具在实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀一、接种1、接种定义1．接种针2.接种环3.接种钩4.100划线接种法斜面接种法涂布接种法液体接种法半固体穿刺接种法

3、微生物检验常见接种方法划线接种法101图4-2平板划线分离法

1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法

1）、平板划线分离法图4-2平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法102平板划线分离法--分区划线分离法（1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3……区依次划线；（2)每划完一个区域，转动培养皿约70度角，并将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域；（3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1～2次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落；（4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。平板划线分离法--分区划线分离法（1)用接种环先将培养物涂布103微生物检验的基本操作技术课件1042）、斜面接种法

主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。以菌种移种为例，其接种方法是：（1）取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培养基管位于内侧；（2）右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接种环；（3）以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次；2）、斜面接种法主要用于经划线分离培养所获得的105斜面接种操作斜106（4）将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端；（5）取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好；（6）做好标识，置35℃培养箱中培养18~24小时。斜面培养一般形成均匀一致的菌苔。一般可观察表面、透明度、色泽等特征。（4）将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸107大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面大肠杆菌斜面1083）稀释涂布分离法：用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，然后分别倒置于37℃温箱中培养。3）稀释涂布分离法：用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀1094）、液体接种法（肉汤接种）（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管；（2）灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以18~24小时培养后观察生长特征。肉汤培养可观察如下几项：a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛；b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、有颗粒、絮状生长；c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）；d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、颗粒、皱状）；e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察是否产酸和有无气体。

4）、液体接种法（肉汤接种）（1）如斜面接种法持好菌种管及培1105）、穿刺接种法（半固体接种）

多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌的某些生化反应。（1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管；（2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出；（3）经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细菌有动力。5）、穿刺接种法（半固体接种）多用于保存111液体接种半固体穿刺营养肉汤：液体变混浊半固体琼脂培养基（0.5%）：扩散生长液体接种半固体穿刺营养肉汤：液体变混浊半固体琼脂培养基（0.112二、分离纯化1、几个定义混和培养物：含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）；纯培养：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）；分离纯化：在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物，得到纯培养的过程称为分离纯化。包括倾注平板法、涂布平板法、平板划线法等等。二、分离纯化1、几个定义113

将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，然后分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，待凝固之后，把这平板倒置在恒温培养箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。整个操作过程应严格按照无菌操作。2、倾注平板法（倒平板）将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，然后分别倒114倒平板技术倒平板技术115三、微生物的培养方法微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。通常分为：一般培养法（需氧培养）厌氧培养法CO2培养法三、微生物的培养方法微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外1161、一般培养法（需氧培养）培养温度:25~37℃2、厌氧培养方法（1）简易的厌氧培养法：A、庖肉培养法B、铁丝圈厌氧培养法C、焦性没食子酸法（2）厌氧罐法（3）厌氧手套箱法1、一般培养法（需氧培养）117厌氧缸法厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。厌氧缸法118微生物检验的基本操作技术课件119厌氧手套箱厌氧手套箱1203、二氧化碳培养法1）烛缸法2）二氧化碳置换法3）化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入。4）二氧化碳培养箱法3、二氧化碳培养法1）烛缸法121二氧化碳培养法烛缸法化学法二氧化碳培养法烛缸法化学法122二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱123四、微生物常规鉴定技术

1、形态结构和培养特性观察1）、在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；2）、在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等；3）、半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。四、微生物常规鉴定技术1、形态结构和培养特性观察1241.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5