丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书

丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。职责负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。：负责监督和指导实验室各方面工作。原理PCRRT-PCR(CT样本要求：血清标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2ml，注入无菌的真空采血管(未加抗凝) ，室温(22-25C30-60min1.5ml标本保存和运送

或直接使用水平离心机，1500rpm离心所采集的标本可立即用于测试或长期保存于 -70C,也可保存-20C待测，保存期为3个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用干冰(或者冰袋)保持低温，运输时间不应超过拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。

4天。仪器和试剂设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公产品标准批号： YZB/国7271-2013最低检出量：最低检出量为试剂各组分见表1:表 1 试

500

剂 盒 组 分 表组分名称组分名称规格数量RNA提取液A200ul/管1核酸提取试剂RNA提取液B5ml/瓶2DEPCH2OHCV3ml/瓶1100ul/管1PCRHCV反应液A270ul/管1HCV反应液B30ul/管1阴性质控品200ul/管1质控品HCV200ul/管1HCV200ul/管1操作步骤试剂准备（试剂储存和准备区）进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检验流程记录表上做相应记录。PCR取出HCV反应液A、HCV反应液AB，室温溶化后振荡混匀， 8000rpm离心数秒后使用。取出N个（N=待测样本+4个HCV阳性定量标准+HCV强阳性质控+HCV临界阳性质控品阴性质控+空白孔）PCR反应管，HCV单人份扩增体系配制见表 2:表2PCR反应液配置表组分组分HCV反应液AHCV反应液B总体积用量/人份27ul3ul30ul将各组分充分混匀，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底， 之后将30ul扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。75%2.25mlDEPCH2O6.75mlRNA（标本制备区）进入标本制备区，从传递窗中取出 PCR反应管和乙醇，放入标本制备区冰箱冷藏。提取液B65C，使仪器自动升温。用镊子夹取n1.5ml+HCV）

RNA提取液A、RNA（n=待测样本数+3=待测样本10ul200ul800ulRNAB,15s分混匀，室温放置时离心。）

5min（每隔1min旋涡振荡5s,使裂解更充分，处理结束后瞬200ul15s20ulRNA提取液A，漩涡5s,1min。8000rpm1min，小心吸弃上清。200ulRNAB,盖紧管盖，充分混匀（用移液枪吹打）8000rpm1min，小心吸弃上清。400ul8000rpm1min，小心吸弃上清。400ul8000rpm1min，小心吸弃上清。5min，使液体挥发完全。温育5min后，用镊子从金属浴中取出离心管，加入 50ulDEPCH2O，用移液枪吹打混匀，室1min8000rpm1min-70C。7.2.13取出已分装好的PCR反应管，向对应编号的PCR管中加入处理好的的样品（包括待测标本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各 20ul，空白对照不加模板，盖紧反应管。8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区。（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。）PCRPCR732在“Setup”按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测标本，并在“sampl®ame”Dye1QuencherDye1：none；ReporterDye2：VIC，QuencherDye2none；PassiveReferenceNONEAB7500 RunMethodC15min195C5min,1个循环；94C15sT55C45s(收集荧光)，45个循环；保存文件，运行仪器。结果分析反应结束后，操作人员可根据实际情况自行调节 Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15,End值可设在5-20。在Log图谱窗口设置的Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线。点击 Analysis自动获得分析结果，在Report界面查看结果，记录样本数值(C)。FAMVICRNA如果反应体系扩增曲线在 FAM、VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道CT<45;或者FAMHCVRNA质量控制

CT<45，在VIC检测通道无对数增长期，则判定样品HCVHCV进行检测结果的判断。试剂盒自带质控(1)阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期，VIC检测通道扩增曲线有明显对数增长期。2)HCVFAMCTw30,FAM检测通道w36。

FAM检(3)阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，且0.97Wrw1。室内质控每次实验应选择适当的HCVRNA质控品做室内质控。9.19.2干扰因素RNaseRNAPCR求采集,操作中应小心谨慎,标本容器及实验用具应鉴定合格。提取,以及时发现交叉污染。1.0x102IU/ml~1.0x108lU/ml警示/HCVRNA/危急值。异常结果处理HCVRNA临床意义HCV感染诊断的指标，指导临床治疗。变异的潜在来源标本保存不当或反复冻融,都会影响检测结果的准确。注意事项阳性质控品和检测样本均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。样品的处理操作应在生物安全柜内进行。所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于 -20C待用（24。操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。标本制备区所用到的试管、吸头等需打入盛有消毒剂的容器，并与废物一起灭菌后方可丢弃。扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。10每次实验均应有质量控制。实验完毕用10