植物组织培养实验室的组成仪器设备及基本操作精要

植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作一、植物组织培养实验室的结构及设计要求：

完整的植物组织培养室通常包括洗涤室、化学实验室、接种室、培养室、细胞学实验室等部分。可以根据实际需要和条件进行设计。但从功能上至少包括准备室（化学实验室）、接种室以及培养室三部分，并且按顺序排列。在化学实验室与接种室之间应留有缓冲空间。第一节实验室结构、仪器设备及操作技术（一）准备室（化学实验室）：

1.主要功能：

用于培养器皿的清洗、干燥、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。

2.主要仪器设备及用品：药品柜、实验台、水槽、超声波洗涤仪、凉干架、干燥箱、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、三角瓶等）、蒸馏水制造装置。天平、移液器、pH计、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、及培养基分装用品等、高压灭菌锅、冰箱。（二）接种室（无菌操作室）：

1、功能：

接种材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。2、仪器设备及用品：

超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。（三）培养室：

1、功能：主要用于植物材料的培养。要求室内洁净并能保持一定的温度、光照以及湿度，以促进植物材料的生长和分化。2、仪器设备及用品：

培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器、加湿及除湿器、光照培养箱等。（四）细胞学实验室：

1、功能：

主要用于培养材料的显微观察及照相等。2、仪式设备备及用品：：体视显微镜镜、普通显显微镜、倒倒置显微镜镜、荧光显显微镜、配配套显微照照相装置、、普通相机机或数码相相机、切片片机及配套套制片及染染色用品等等。体视显微镜镜用途：放大大倍数5~80倍主要用于于植物形态态分化的观观察、茎尖尖的切取。。普通光学显显微镜用途：用于于植物切片片观察，确确定植物的的发育进程程，如：不不定芽、不不定胚的分分化过程以以及其它器器官组织的的分化等。。倒置显微镜镜用途：主要要用于细胞胞、原生质质体的细胞胞分裂和细细胞团形成成的观察。。（一）洗涤涤：1.普通器皿：：采用洗衣衣粉、洗洁洁精等中性性洗涤剂洗洗涤。2.难清洗器皿皿及移液管管等：用水水清洗后再再用重铬酸酸钾洗液浸浸泡，最后后清水冲洗洗，或用超超声波仪清清洗。重铬酸钾洗洗液的配制制方法：43g重铬酸钾溶溶于1000ml蒸馏水中，，将浓硫酸酸缓慢倒入入重铬酸钾钾溶液中，，浓度比例例为1：1。二、实验室室基本操作作：1、器具灭菌菌：培养皿皿、解剖刀刀、镊子等等用品。（1）干热灭菌菌：铝箔包好后后，放于恒恒温干燥箱箱内，150℃保温2小时，成本本较高。（2）高压蒸汽汽灭菌：高压蒸汽灭灭菌锅内120℃15－20分钟。（3）灼烧灭菌菌：接种时，解解剖刀及镊镊子等浸入入95％乙醇，然然后取出在在酒精灯火火焰上灼烧烧杀菌。（二）灭菌菌：灭菌是指用物理和和化学方法法杀死物体体表面和内内部的所有有微生物（包括芽胞胞），使之呈无无菌状态。。经过灭菌的的物品称““无菌物品品”。2、培养基灭灭菌：采用高压蒸蒸汽灭菌。。120℃15－20分钟。培养基体积积越大，灭灭菌时间越越长。高温高压灭灭菌对培养养基成分的的影响：a.pH值普遍下降降。b.产生混浊或或沉淀，这这主要是由由于一些离离子发生化化学反应而而产生混浊浊或沉淀。。例如Ca+2与PO4-3化合，就会会产生磷酸酸钙沉淀。。c.不少培养基基颜色加深深。d.体积和浓度度有所变化化。e.营养成分有有时受到破破坏。3、不耐高温温材料的灭灭菌：采用过滤灭灭菌，如IAA、ZT、天然有机机添加物等等。4、外植体的的表面灭菌菌：采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效效氯1％的次氯酸酸钠（5-30分钟）、0.1－0.2%的氯化汞（（2-15分钟）等杀杀菌剂中加加入几滴吐吐温－20或80（Tween－20或80）效果较好好。（三）无菌菌操作：1、保持接种室室的无污染染环境，定期熏蒸蒸或喷雾处处理。接种种前打开超超净工作台台及紫外灯灯照射20-30分钟，关闭闭紫外等灯灯后使气体体散出后开开始操作。。2、保持超净工工作台的洁洁净：接种前用70％乙醇擦拭拭台面或用用喷壶喷雾雾，操作前前，将手和和手臂用70％乙醇消毒毒，所需试试验用品用用乙醇擦拭拭后放入超超净工作台台。3、点燃酒精精灯，进行行操作，接种材料前前后，灼烧烧瓶口，工具要灼烧烧彻底，防防止交叉污污染。4、保持培养室室的洁净，，发现污染染及时挑出出，以减少污染染源。5、操作中穿工工作服、戴戴口罩、工工作帽，出入接种室室换拖鞋以以保持接种种室的洁净净。第二章植植物组织培培养实验室室的组成、、

仪器设设备及基本本操作第一节实实验室结构构、仪器设设备及操作作技术一、植物组组织培养实实验室的结结构及设计计要求二、实验验室基本操操作第二章植植物组织培培养实验室室的组成、仪器设设备及基本本操作第二节培培养基的组组成、配制制与灭菌一、培养基基（medium）的组成和和作用通常植物组组织培养所所用培养基基包括以下下六大类成成分，即矿质营养、、有机成分分、植物生生长调节剂剂、碳源、、琼脂以及及其他附加加物等。培养基的主主要指标是是:营养成分的的浓度植物生长调调节物质的的浓度（一）矿质质营养：矿质营养又又称无机营营养，是指指植物生长长发育所需需要的各种种化学元素素。矿质元素的的生理作用用：（1）组成各种种化合物，，成为结构构物质；（2）许多酶和和附酶的组组成部分，，参与代谢谢；（3）维持离子子平衡、胶胶体稳定及及电荷平衡衡等电化学学作用；（4）影响形态态发生和组组织、器官官的建成等等。根据据植植物物对对元元素素的的吸吸收收量量，，可可以以把把植植物物必必需需元元素素分分为为大大量量元元素素和和微微量量元元素素。。国际际植植物物生生理理学学会会规规定定植植物物所所需需浓浓度度大大于于0.5mmol/l的的的元元素素称称为为大大量量元元素素。。低低于于0.5mmol/l的元元素素称称为为微微量量元元素素。。大量量元元素素：：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S分别别占占植植物物干干重重的的百百分分数数为为18％、、10％、、70％、、0.3%、0.07％、、0.3%、0.3％、、0.07%、0.05％。。微量量元元素素：：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。1、大大量量元元素素：：N、P、K、Ca、Mg、S等6种大大量量元元素素依依靠靠各各种种无无机机盐盐提提供供。。不同同植植物物种种类类和和不不同同试试验验目目的的对对元元素素的的使使用用量量要要求求不不同同，，需需经经试试验验确确定定。。目前前已已选选择择出出多多种种培培养养基基配配方方用用于于植植物物组组织织培培养养。。其其中中以以MS应用用最最广广泛泛。。以MS为例例6中矿矿质质元元素素分分别别由由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供供。。大量量元元素素中中的的氮氮通通常常采采用用硝硝态态氮氮或或铵铵态态氮氮，，但但铵铵态态氮氮浓浓度度过过高高会会对对有有些些植植物物的的培培养养物物造造成成伤伤害害，，不不适适宜宜使使用用过过高高的的浓浓度度，，可可以以用用谷谷氨氨酸酸、、丝丝氨氨酸酸等等来来代代替替。。2、微微量量元元素素：：植物物组组织织的的对对其其需需要要量量极极少少，，过过多多会会产产生生毒毒害害，，如如造造成成蛋蛋白白质质变变性性、、酶酶失失活活,代谢谢障障碍碍等等。。各种种微微量量元元素素均均具具有有特特定定的的生生理理功功能能，，如如硼硼与与蛋蛋白白质质的的合合成成及及糖糖类类的的运运输输有有关关；；铜铜能能促促进进离离体体根根的的形形成成；；锰锰参参与与植植物物的的光光合合作作用用和和呼呼吸吸作作用用；；钼钼为为氮氮素素代代谢谢的的重重要要元元素素。。微量量元元素素中中，，铁铁的的用用量量较较大大，，它它对对叶叶绿绿素素的的合合成成起起重重要要作作用用，，由由于于在在较较高高pH下，，FeCl3极易易形形成成Fe（OH）3沉淀淀，，难难以以被被吸吸收收，，所所以以多多用用乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸二二钠钠盐盐与与硫硫酸酸亚亚铁铁形形成成的的螯螯合合物物，，并并且且单单独独配配制制。。（二二））有有机机成成分分：：主要要包包括括各各种种维生生素素和和氨氨基基酸酸常用用的的维维生生素素：：硫硫胺胺素素（（VB1）、、吡吡哆哆醇醇（（VB6）、烟酸酸（VB3）、泛酸酸钙（VB5）、生物物素、钴钴胺素（（VB12）、叶酸酸等。常用的氨氨基酸：：甘氨酸酸、谷氨氨酸、谷谷氨酰胺胺、丝氨氨酸、精精氨酸、、天冬氨氨酸、天天冬酰氨氨、丙氨氨酸等。。有时添加加水解乳乳蛋白或或水解酪酪蛋白，，为牛乳乳经酶法法加工的的水解产产物，含含有20种氨基酸酸的混合合物，用用量10－1000mg/L,通常用于于原生质质体等培培养。此外肌醇是另外一一种重要要的有机机成分，，在维持持离子平平衡，糖糖类的转转化中起起重要作作用，此此外还参参与磷脂脂代谢及及等生理理作用。。它可以以促进愈愈伤组织织的形成成，不定定芽、不不定胚的的分化。。（三）植植物生长长调节物物质：植物激素素是植物物代谢中中产生的的天然化化合物，，它能直直接影响响植物细细胞的分分化、分分裂以及及影响植植物的形形态建成成、开花花、结实实、成熟熟、衰老老脱落、、休眠、、萌发等等生理活活动。在植物组组织培养养中，主主要通过过植物激激素及生生长调节节物质对对离体的的组织、、器官的的形态发发生进行行调控。。包括诱诱导细胞分裂裂、愈伤伤组织的的生长、、根芽的的分化以以及体细细胞胚胎胎发生等等。常用的植植物激素素及生长长调节物物涉及五五大类植植物激素素：1、生长素素类：2、细胞分分裂类：：3、赤霉素素类：4、脱落酸酸：5、多胺6、乙烯：：1、生长素素类：组织培养养中的功功能是：：促进细细胞伸长长生长和和细胞分分裂，诱诱导形成成愈伤组组织，促促进生根根。常用的有有NAA、IAA、IBA、2,4－D等。2、细胞分分裂素类类：功能：诱诱导芽的的分化、、促进侧侧芽萌发发；促进进细胞分分裂和扩扩大，促促进茎增增粗，抑抑制茎伸伸长；延延缓衰老老。常用细胞胞分裂素素有BA、KT、ZT、2ip等。此外近年年来发现现苯基脲脲衍生物物具有非非常高的的细胞分分裂素活活性，在在多种植植物上应应用。如TDZ，CPPU，4－PU等。3、赤霉素素类：主要具有有诱导茎茎的细胞胞伸长，，对根无无效；对对形成层层细胞分分化有影影响，与与生长素素协同作作用；可可以诱导导离体成成花；打破休眠眠等功能。。常用GA3、GA4等。4、脱落酸酸（ABA）：促进休眠眠、衰老老和脱落落。组织织培养中中较少使使用，主主要用于于种质资源源的离体体保存。5、乙烯：：主要促进进衰老和和脱落，，高浓度度易形态态变化。。（四）碳碳源：碳源主要要为细胞胞提供合合成新化化合物的的骨架，，为细胞胞的呼吸吸代谢提提供底物物与能源源，此外外还能维维持一定定的渗透透压。常用的碳碳源主要要是蔗糖糖，使用用浓度在在10－50g/L，此外果果糖、葡葡萄糖、、麦芽糖糖、山梨梨糖、甘甘露糖及及可溶性性淀粉等等也常用用于植物物组织培培养。（五）琼琼脂：琼脂作为为固化剂剂用于组组织培养养中，起起支持植植物的作作用，不不提供营营养，为为海藻中中提取的的一种高高分子化化合物，，仅溶于于热水（（90oC以上），，成为凝凝胶，冷冷却后（（40oC以下）即即凝固为为凝胶。。琼脂的用用量通常常在4～10g/L。（六）有有机附加加物：1、椰子汁汁：用量为100～200g/L。2、香蕉泥泥：使用量为为150～200g/L。3、苹果汁汁、番茄茄汁等。。（七）其其他成分分：1、活性炭炭：使用用量为0.2-1%。2、抗生素素：常用用青霉素素、链霉霉素、庆庆大霉素素等，用用量在5～20mg/L。3、抑制酚酚类物质质：抗坏坏血酸.4、生长抑抑制剂：：常用矮壮壮素、比比久（B9）、多效效唑（pp333）、三三碘苯甲甲酸、根根皮酚等等.二、培养养基的类类型：1、高盐浓度度培养基基：MS、B5、SH等。适用于多多数营养养需求量量较大的的植物。。2、低盐培养养基：WPM、White、Nitsh等。适用于木木本植物物的培养养。表1

MS培养基的组成配方组成成分数量(mg/l)组成成分数量(mg/l)NH4NO31650Na2-EDTA37.3KNO31900FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O440CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O370蔗糖30KH2PO4170pH5.8KI0.83肌醇100.0H3BO36.2烟酸0.5MnSO4·4H2O22.3盐酸吡哆醇0.5ZnSO4·7H2O8.6甘氨酸2.0Na2MoO4·2H2O0.25盐酸硫铵等0.4CoCl2·6H2O0.025表2

B5培养基的组成和配方组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l)KNO32500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4

134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO4

3.0烟酸1.0MnSO4·4H2O10盐酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激动素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025盐酸硫铵10Na2-EDTA37.3表3N6培养基的的组成和和配方组成成分数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇0.5H3BO3

1.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4盐酸硫铵1.0ZnSO4·7H2O1.5三、培养养基母液液及激素素母液的的配制：：由于培养养基中元元素用量量少，种种类多，，因此每每次称量量繁琐，，因此通通常将各各种营养养成分配配制成母母液保存存。大量元素素微量元素素有机营养养激素1、器皿和和用具的的准备仪器包括括万分之之一天平平，百分分之一天天平，pH计用品包括括不同型型号的烧烧杯（2000ml、1000ml、100ml），容量量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、试剂剂瓶若干干（1000ml、250ml）、移液液器（1000ul、200ul）、滴管管、玻璃璃棒、试试管、各各种规格格三角瓶瓶（150ml、100ml、50ml）、培养养基分装装器，漏漏斗、称称量纸、、标签纸纸、不同同范围pH试纸、铅铅笔等。。玻璃器皿皿用前清清洗干净净。2、药品及及蒸馏水水准备：：药品采用用分析纯纯或化学学纯试剂剂。水利用蒸蒸馏水或或去离子子水。3、母液配配制：（1）配制母母液原则则：相同类型型的试剂剂混合；；易形成沉沉淀的药药品分开开；母液浓度度要适宜宜；用量要认认真计算算和核对对；药品要要准确确称量量。（2）MS培养基基母液液的配配制：：MS培养基基母液液根据据试剂剂特性性通常常配成成四种种母液液，即即大量元元素母母液（10或20倍）、、微量元元素母母液（100或1000倍）、、Fe盐（100倍）、、有机物物（100倍）。。配置前前先进进行根根据培培养基基组成成和配配制体体积计计算母母液试试剂用用量，，然后后称取取药品品，大大量元元素可可以用用百分分之一一或千千分之之一天天平，，微量量元素素，铁铁盐和和有机机物用用万分分之一一天平平称量量。（