分子医学实验学

《分子医学实验学》实验指导供口腔、护理、药学各专业用（第一版）佛山科学技术学院医学院编2008年6月编写说明《分子医学实验学》是一门集生物化学、免疫学、生物化学技术和分子生物学基本实验、科研探索和医学应用于一体的全新的综合性实验课程。其实验技术反映现代生物医学发展趋势。《分子医学实验》是基础医学实验教学的重要组成部分，是医学各本科专业的专业基础必修课。课程内容包括分子医学基本实验技术、基础实验及综合和设计性实验等部分。课程的主要目的一是强化基础知识教育，突出基本技能训练，是使学生能掌握分子医学的经典理论和基本实验，二是培养学生综合性素质，开发学生的科研潜能和创新思维。开设分子医学实验学的目的在于：1、验证和巩固理论知识，加深对理论知识的全面理解，加强记忆。2、通过实验，掌握分子医学实验学的基本操作技术，掌握层析法,电泳法,分光光度法和生物大分子制备等常用的实验方法的基本原理，熟悉分子医学实验的一般知识。3、培养学生观察、比较、思考及分析问题和解决问题的能力，使学生具备一定的动手操作能力、创新能力培养学生科学、严谨、认真工作态度及理论联系实际、实事求是的工作作风。本实验指导11个实验项目涵盖了分子医学实验学中沉淀、离心、层析、电泳、分光光度测定等分子医学实验的基本方法，可依实验所需时间作合理组合实验，根据实验条件和教学安排适时开课。实验室规则1．实验前必须预习实验指导和相关理论知识，明确实验目的、原理、预期的实验结果、操作关键步骤及注意事项，计划安排实验工作时间。穿白大衣准时进入实验室，保持实验室整洁安静，不得谈笑和大声说话，不准做与实验无关的事情。3．实验时应持“三严”作风——态度严谨、思维严密、操作严格。实验中认真、仔细观察实验过程中的实验现象和结果，及时如实的做好原始记录。实验失败须重做。根据实验结果进行科学分析，写好实验报告，交指导教师批阅。4．注意安全，不得擅自离开。使用易燃、易爆、有毒试剂和材料进行实验时，应严格遵守操作规程，防止火灾、中毒、污染、触电等事故发生，一旦发生，果断处理并立即报告教师爱护公物，防止损坏，若有损坏及时报告原因并登记。公用仪器就原处使用，了解使用方法及遵守操作规程，使用后必须在仪器登记本上登记并签名。公用试剂就近量取、用毕随时放回原处。要节约水、电、煤气及试剂药品6．实验结束，洗净器材，清整实验室，打扫卫生，检查门、窗、水、电和煤气的安全。目录实验一实验室基本知识和技术（5）实验二蛋白质浓度测定（双缩脲法）（21）实验三醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质（23）附：电泳技术（27）实验四血浆清蛋白的分离纯化与鉴定（35）附：层析技术（37）实验五胰岛素及肾上腺素对血糖浓度的影响（45）实验六脱氧核糖核酸（DNA）的提取及成分鉴定（48）实验七质粒DNA提取与纯化（51）实验八DNA重组质粒的设计与构建（54）实验九凝集试验（61）实验十肝功能组合实验（65）附1：血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定附2：酶联免疫吸附试验（ELISA）实验十一免疫血清的制备（71）实验一实验室基本知识和技术（Thebasicknowledgeandtechnologyoflab）【目的和要求】掌握各种基本的生化技术、常用仪器的分类、使用及注意事项熟悉生化实验室规则3．清点洗刷实验用具。【实验内容】实验室规则生物化学实验各种基本技术722型分光光度计的使用实验记录和实验报告【仪器、设备】1.烧杯2.试管3.刻度吸量管4.离心管5.滴管6.搅棒7.枪式移液器及其配适吸头8.混匀器9.恒温水浴箱10.离心机11．722型分光光度计，721型分光光度计第一部分基本知识与操作一、常用的玻璃仪器分类：常用的玻璃仪器分类有量器和容器，“量器”主要包括：量筒、量杯、容量瓶、吸管等。“容器”主要有烧瓶、烧杯、试管、试剂瓶、离心管等。量器有量入式和量出式两种形式。“量入式”用“ＴＣ”、“Ｅ”、“λ”表示，定量标记由下往上递增，测量注入量器中的液体；“量出式”用“TD”、“A”表示；定量标记由上而下递增；测量从量器中倾出的液体。（二）玻璃仪器的洗涤、干燥1、洗涤液：①洗洁精，肥皂水，洗衣粉。②玻璃仪器专用洗涤液：主要成份为中性稀氯氧化剂，上海日化研究所出品2、洗涤的要求与步骤：要求：洁净的玻璃器皿表面应不挂任何水滴。步骤：不净的器皿洗衣粉或肥皂水刷洗自来水冲净达到要求？是浸入洗液(数小时至过夜)自来水冲净蒸馏水涮洗2—3次(其目的是去除自来水中的杂质，故应少量多次，全面充分)烤干或晾干、备用注意：对使用过的仪器应养成及时清洗的习惯，特别是血液分析时用以吸取血液样本的吸管，用过后应当立即用水将所沾的血液冲去，否则放置过久，血液干燥硬结，就很不容易清除。①新购置的玻仪：合成洗涤剂洗刷→→0.2mol/L盐酸浸泡（去除游离碱）２―６小时→→自来水冲洗→→ＤＳ冲洗２――３次。②一般容器：如试管、烧杯、三角烧瓶等。流水冲洗→→合成洗涤剂洗刷→→自来水多次冲洗→→ＤＳ冲洗。③容量分析仪器：如吸管、容量瓶、量筒、滴定管等。使用后立即浸泡水中。自来水多次冲洗→→沥干→→铬酸洗液浸泡数小时→→自来水多次冲洗→→ＤＳ冲洗２――３次。（不能刷洗）④比色杯：用毕立即用ＤＳ反复冲洗。洗不净时，用盐酸冲洗，再用自来水冲洗和蒸馏水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙纸试擦3、玻璃仪器的干燥一般的玻璃仪器均可洗净后倒置架上，让其水分蒸发自然干燥，如需迅速干燥者应按仪器的不同类型按下述不同方法处理：①试管、离心管、烧杯、烧瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100—105℃②少量仪器如需急用也可在电炉上或酒精灯上烘烤。烘烤时应将器皿时时转动，务使受热缓慢且均匀，并将管口(或杯口)倾斜向下，以便水蒸气冷凝成水滴，顺口流出，不致使水滴接触烘热了的器壁而使仪器爆裂。③使用电吹风干燥一般玻璃仪器也很便利常用。④下列玻璃仪器应避免烘烤：各种计量玻仪：不可烘烤，自然干燥（容易造成器壁变形而致容量不准）。常用定量吸管很难自然干燥，可在８０至１００℃烘箱烤干。厚壁玻仪（研钵、量筒比色杯：等）及结构复查的玻仪：易在烘烤时发生破裂，不可烘烤，自然干燥。（自然干燥适应于不急于使用和各种计量玻仪；烘烤干燥除结构复杂、厚壁及计量玻仪外，均可。温度在１２０℃，刻度吸管温度应小于１００℃常规操作技术及注意（一）移液操作用于移液操作的有奥氏吸管、移液管、刻度吸管三种吸量管及枪式移液器。三种吸量管比较奥氏吸管移液管刻度吸管特点管中有一球形膨起管中有棱形膨出直筒状只有一个刻度只有一个刻度有多个刻度准确度最高次之再次之应用适用于吸取标准液吸取标准液生化实验中广泛使用或粘稠性血标本管尖液吹不吹吹（完全流出式）停留15秒不吹（不完全流出式）流速愈慢愈好慢流出快流出1、吸量管的使用吸量管的选择：·在一次完成转移的前提下，应选用容量较小的吸量管·对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管②操作(见图1—1)·用洗耳球将液体吸至超过标线·移开洗耳球，迅速用食指压紧管口·必要时将管尖端外围拭净·调液面至标线·放开食指，使液体流入容器·将最后液滴沿器壁而下或吹出③读数(见图1—2)·吸量管保持垂直·视线与液面应水平·管中液面与刻度线应呈切线使用注意：持管方式；管尖插入液面的深度；吸液；读数（认刻度，准确读数，注意无色液与有色液读数之区别）；放液（吹与不吹之分，注：对于刻度由上至下的吸量管应尽量使用上端刻度管尖残液是否需吹出，看清标记）。2、枪式定量移液器的使用①抢式移液器的结构(见图3)（1.液体吸放钮2．体积选取钮3.体积、显示4．枪头排放钮5.枪头排放器6．枪头接嘴）其内部柱塞分2段行程，第1档为吸液，第2档为放液，手感十分清楚。种类：固定式和可调式规格：0.5――10000ul不等②操作(见图1—4)·正式使用之前，要连续按动数次，使管内空气同工作环境空气交换，保持管内工作负压恒定·调体积选取钮至所需值，在移液管下端插上塑料吸嘴，轻轻扭转以保证所密·垂直持握枪式移液器外壳，按下大拇指至第1档·将吸嘴垂直地浸入所需取样液内，深度为2~3毫米，徐徐松开大拇指，使之返回原来位置。·停留1――2秒，平缓地将移液管取出，同时应避免吸嘴与任何东西碰撞。·将吸液嘴移至加样容器壁上，缓慢按动按手至第一档，将液体排了。停留1秒（粘性较高的溶液停留时间可长些）。紧接着再将按手按至第二档，排出吸嘴里的全部液体。（要求动作连）。·完全排出液体后，小心地连同吸嘴沿着容器壁向上滑动取出。·再放松按手，使之返回原来位置，即完成一次操作。如需移取另一样品，按枪头排放钮，更换枪头注意：·移液器是精密量取，不允许将移液器直接与液体接触。·不使用时也应插上塑料吸嘴，以免液体或染色液吸入移液器内，导致阻塞。·移取过程中应控制速度，力度。·塑料吸嘴可经受100℃（二）混匀操作(1)旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转(2)指弹法：一手执试管上端，另一手轻弹试管下部，：使其中液体作涡旋运动。(3)搅动法：使用玻璃棒搅边；多用于溶解烧杯中的固体。(4)混匀器法：将试管置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。(5)倒转混匀：适用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞离心管等。操作时，将容器反复倒转。试管内的液量太多，也可利用倒转混匀法，外面包以玻璃纸塞住管口，然后用手指按住橡皮塞将试管反复倒转，溶液即可充分混匀。(6)吸管混匀法：用吸管将溶液反复吸吹数次，以达到混匀的目的。（三）加热与保温操作1、加热(见图1~5；图1~6)2、保温①使用恒温水浴箱，调节温度设定钮至需要的温度。②水浴箱中水要足量。③实验过程中应随时监测温度，并及时调节。（四）离心操作离心沉淀法：当颗粒小而不均一，沉淀粘稠或容积小又需精确定量时，往往采用离心沉降法。1、离心前检查：①取出所有套管，起动空载的离心机，看是否转动平稳。②检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物。③离心管与套管是否匹配。2、平衡：将一对离心管放入套管，置于天平两侧，用滴管较轻一侧的离心管与套管之间加水至两侧平衡(离心管及其内溶液量不能差别过大)3、离心：将等重的两管置于离心机中的对称位置，调转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，计时，离心结束后，将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。4、使用注意①根据需要选择合适的转速、时间；②选择合适的离心管，做到对称平衡；③启动时应由低速慢慢加至所需速度④离心结束关机后，应让其自然停止，不可用手或其它物品强迫停止（五）点收仪器根据仪器清单，逐项查点是否完好(如有缺损向教师声明及时补充更换)第二部分分光光度法当光线通过透明溶液介质时，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透过，所以光线射出溶液介质之后光能被减少。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性地吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的透过程度相同，这种物质就是无色透明的，若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，并与被吸收的光的颜色完全互补。任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的，一些有色物质可以选择性地吸收一部分可见光区的光的能量而呈现不同颜色，一些物质却能特征性地选择吸收紫外线的能量。物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成特定的吸收光谱。由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关，而且在一定条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，所以可利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和定量分析。分光光度法是利用各种物质所具有的这种吸收特征所建立起来的分析方法。一、分光光度分析法的基本原理劳伯—比尔定律(Lambert-Beerlaw)是讨论吸收光能与溶液浓度和溶质层厚度之间关系的基本定律，是分光分析的理论基础。劳伯—比尔定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体（一）Lambert氏定律一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系(见图2—1)。表达式为这里I0为入射光强度I为通过溶液介质后的光强度L为溶液介质的径长(pathlength)k为吸光系数(absorptioncoefficient)(g·cm-1)（二）Beer氏定律以溶液介质浓度变化代替溶液介质厚度的改变，光能的吸收与浓度改变有类同的关系，即一束单色光通过溶液介质时，光能被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液介质浓度有一定的比例关系。得出下式：这里C(Concentration)为溶液介质的浓度(g·L-1)将Lambent氏定律和Beer氏定律合并，即(1)和(2)合并为式中A(Absorbance)为吸光度T(Transmittance)为透光度(4)式也可表达为A=εCb…………..(5)式中ε(epsilon)称之摩尔吸光率(Molarabsorptivity)(mol／L-1cm-1C(concentration)浓度(mol／L)b(pathlength)溶液样品的长度cm(或比色皿内径长cm)(5)式为lambert—Beer定律的物理表示式，其含义为一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。此式为分光分析法的基本计算式。如果实验中溶液厚度b=lcm则A=εC图2—2表明，在溶液介质厚度一定的情况下，吸光度(A)、透光度(T)和溶液介质浓度(C)之间的关系。摩尔吸光率(ε)实际上是物质在单位浓变和单位厚度下对入射光的吸光度，在一定波长下，ε越大表示物质对光的吸收越强。二、分光光度法的定性定量方法许多对光有吸收的物质可以直接用分光光度法进行定量分析：一些对光，包括紫外、可见或近红外都无吸收的物质亦可通过和某些化学试剂作用而呈色，在一定的反应条件下和一定的浓度范围内，溶液颜色的深浅(对光吸收的程度)和该溶液中显色物质的浓度呈正比。(一)测定波长的选择使用分光法测定溶液中物质的含量，首先要选择最适单色波长，因为只有以能被溶液吸收的光束作为入射光才能符合Lambert—Beer定律。测定有色物质时，不同颜色的待测溶液，则应选择不同波长的单色光束。在分光光度计上，单色光波长的选择原则一般是使被测溶液的单位浓度的吸光度变化最大，同时还要具有最小的空白及干扰读数，借以获得最高的灵敏度和正确性。最理想的办法是对每种物质的测定都应先傲它的光谱吸收曲线及有关干扰物的吸收曲线，根据这些光谱吸收曲线来选择最佳测定波长。表2—2可供波长选择的参考。(二)分光光度法定量方法1、利用标准管计算测定物含量最适波长选定以后可进行溶液物质含量的测定。通常都采用对比测定法，即以巳知精确含量的待测物质的溶液作为参考标准物(Cs)和未知待测样品(Cx)用同一方法，在同一条件下、同时进行测定，读取标准物质的吸光度(As)和未知含量的样品吸光度(Ax)，由于标准物质和未知物质是同一物质，其摩尔吸光率(巨)相同和进行测定用的比色皿内径长(b)相同即bs=bx，根据A=εCb式，可得到As=Cs换算成下式Ax=Cx式中Cs是标准管中物质的实际含量，是标准液的浓度与实际用量的乘积；Cx是测定管中物质的实际含量。还应换写到法定单位mmol／L、mg／m1。2、利用标准曲线进行换算配制一系列不同浓度的标准的溶液(至少五个)按测定管同样方法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度(A)，以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度(C)为横坐标，在方格坐标纸上作图，制作标准曲线。以后在同样条件下进行测定时，测定被测溶液的吸光度，从标准曲线上可找出相应的浓度。根据Lambert—Beer定律，标准液的浓度在一定范围内与吸光度呈直线关系，标准曲线是这种直线关系的描述，一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0．05—1．0范围内为宜。还须注意：曲线制作与测定管的测定应在同一仪器上进行，由于曲线的建立与实验室当时的条件如温度，湿度和气压及电压稳定性等有关，因此标准曲线常因各种变化而需校正或重做。3、摩尔吸光率ε求取测定物浓度当浓度为1M／L时，溶液厚度为1cm，吸光率用ε表示，在已知测定物的ε，则可根据下式求得测定物的物质浓度。此计算法常用于紫外吸收，如核苷酸溶液含量测定，如UTP在262nm具有最大吸收峰，利用已知UTP在262nm时的摩尔吸光率ε，读取待测UTP溶液吸光度A，即可求出该UTP浓度。二种以上被测物的混合液，也可利用不同ε进行定量测定。例如a，b两种物质在波长λ1时，摩尔吸光率分别为εa1和εb1：，在波长λ2时摩尔吸光率分别为εa2和εb2，a和b混合的溶液在λ1时吸光度为Al，在λ2时的吸光度为A2(图2—3)，各自浓度分别为Ca和Cb，则如有三种以上成分的混合液，也可通过三种不同波长情况下的吸光度，以各自特有的ε值，依据三元一次方程，同样可求出未分离的三种混合物的各自浓度-‘（三）、物质的定性分析以不同波长的单色光作为入射光，测定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不同波长为横轴，各相应的吸光度为纵轴作图，可得到溶液的吸收光谱曲线。吸收光谱曲线是物质的特征性曲线，它和分子结构有严格的对应关系故可作为定性分析的依据。不同的物质，分子结构不同，其吸收光谱曲线也有其特殊形状(图2—4)。在吸收光谱中，往往可以找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长(入max)。物质不同，它们的波长(nm)最大吸收波长也往往不同，图1—4为维生素B12溶液的吸收光谱曲线。物质用分光分析定性主要依据吸收光谱存在的特征吸收。①比较吸收光谱曲线，在相同情况下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同，因为不同的物质有各自的特征性曲线。如ATP和GTP都属于核苷酸，它们的溶液在紫外光区均有吸收，但由于化学结构不很一样，它们的吸收光谱就有差别。需要注意的是在不同条件(如选择不同溶剂)下，即使是同一物质也可呈现不同的吸收光谱。②比较最大的吸收波长。不同的物质可有不同的最大吸收波长(kmax)。如ATP、GTP、CTP和UTP的λmax分别为259nm、253nm、271nm和262nm。Lnlax可作为物质定量测定的最适波长，此时测定灵敏度最高。有些物质化学结构相近，可产生相同的λmax，伹它们的吸收系数都不一致，可据此鉴别之。③比较吸光度比值。可根据物质两个或几个不同波长的吸光度比值来鉴别不同的物质，同时也可检查物质的纯度。如DNA溶液kmax为260nm。在260nm的吸收度和在280nm的吸收度比值为1．8。但溶液中混进了蛋白质，则比值会降低(蛋白质在280nm处有最大吸收)。三、分光光度计基本结构与使用分光光度计的类型很多，最常用的是可见分光光度计和紫外—可见分光光度计。各种类型的分光光度计的结构和原理基本相同，一般包括光源、单色器、比色杯、检测器和显示器几大部分。光源单色器狭缝吸收杯检测器显示器卤钨灯滤光片玻璃杯将光信号检流计氢灯棱镜石英杯转换为电信号微安表光栅（光电管和数字显示器光电倍增管）（一）光源一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮稳定、光谱范围广和使用寿命长等特点。可见光分光光度计常用的光源是采用稳压调控的钨灯(tungstenlamp)，能发射出350nm~2500nm波长范围的连续光谱，适用于340-900nm范围的光源。现在常用的卤钨灯。紫外光光度常用氢灯(hydrogenlamp)作光源，其发射波长的范围为150nm~400nm。它适用于做200-360nm的紫外分光分析。（二）单色器将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。分光光度法测定某一物质的吸光度需要在某一特定波长下进行，单色光器的作用在于根据需要选择一定波长范围的单色光。在实际工作中欲选择出单个某波长的光线是困难的。所谓单色光是指在此波长有最大发射，而在相邻较长和较短波长范围内的发射能量较少而言。单色光的波长范围愈窄，仪器的敏感度愈高，测量的结果愈可靠。单色器可分为滤光片、棱镜和光栅。滤光片可分为吸收滤光片、截止滤光片、复合滤光片和干涉滤光片。棱镜是用玻璃或石英材料制成的一种分光装置。其原理是利用光从一种介质进入另一种介质时，光的波长不同在棱镜内的传播速度不同，其折射率不同而将不同波长的光分开。见图2—4通过单色光器的发射光的强度可能过强也可能过弱不利于进一步检测。狭缝是由一对隔板在光通路上形成的狭缝。通过调节狭缝的大小来调节入射单色光强度并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的，而光度计和分光光度计的狭缝大小是可调的。（三）比色杯比色杯又吸收杯，是光度测量系统的最重要部分之一。在可见光范围内测量时选用光学玻璃吸收杯，在紫外线范围内测量时要选用石英吸收杯。比色杯的光径0.1~10cm，一般为1cm。注意保护比色杯的质量是取得好的分析结果的重要条件之一。不得用粗糙、坚硬物质接触吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光学面；用后要用水及时冲洗，不得残留测定液，尤其是蛋白质和核酸溶液。（四）检测器硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器，将通过比色杯的光信号转变成电信号。进一步再用适当的方法测量所产生的电流。（五）显示器显示器是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。常用的显示器是有检流计、微安表、记录器和数字显示器。四、几种常用的国产分光光度计（一）72—1型分光光度计该机光谱范围在360—800nm(可见光区)，该机灵敏度较高，而且结构简单，操作方便，可用于有色物质溶液的测定。1、72—1型分光光度计光路图和外形图2、使用方法①开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置测试用波长。仪器预热20分钟。②打开试样室盖(光门自动关闭)。调节“0”旋钮，使数字显示为“00．0”盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率“100％”旋钮，使数字显示为“100.0”。③将选择开关置于“A”。调节消光零旋钮，使得数字显示为“．000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。④如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100％”后稍等片刻，(因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间)，当稳定后，重新调整“0”和100％即可工作。⑤每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。⑥换一波长测试时，应将选择开关置“T”，重复(2)和(3)操作。⑦测试完毕，关闭开关，电源，将比色皿冲洗干净。(三)UV—75—4型紫外分光光度计1、UV—754紫外分光光度计光路图：由光源发出的连续辐射光线，经滤光片和球面反射镜至单色器入射狭缝处聚焦成像，光束通过入射狭缝，经平面反射镜到准直镜，产生平行光射至光栅。在光栅上色散后，又经准直镜聚焦在出射狭缝上成一连续光谱，由出射狭缝射出——定波长的单色光，通过标准溶液再照射到光电管上。光源切换与波长移动相对应‘200nm--290nm需点亮氘灯290nm一360nm需同时点亮氘灯和钨灯360nm--850nm需点亮钨灯单色器采用自准式系统，衍射光栅使用该厂自制1200条／nm的复制闪跃光栅2、测试准备(1)打开电源开关之前，检查一下测试样品室。(2)试样槽置“参考”位置。(3)打开电源开关。如果波长工作在200nm一300nm时需按氘灯触发按钮。(4)显示器显示"754”后，数显为“100．0”，则表明仪器已通过自检程序。此时按A／C键，仪器自动进入“0．000"(5)仪器预热三十分钟。3、测试(1)数显“0．000"稳定后，即可把试样槽置于“样品”位置进行测试(即拉一下样品室滑杆)。待第一个数据自动打印完毕后，再可将试样槽置于第二个“样品”位置测试(即再拉一下样品室滑杆)。(2)每当需要调换波长时，必须把试样槽置于“参考”位置，重新调零，现将测试操作顺序如下：注意：样品号超过99号，打印数复位至00继续计数下去。(四)分光光度计和紫外分光光度计使用注意事项①．光度计的光电管或光电池对不同浓度的光敏度不一样，应注意每换一次波长，即应将空白溶液的吸光度调整到0。②．溶液定量测定，应注意吸光度在0．05—1．0范围，浓度太大时应该适当稀释。③．一般灵敏度旋钮调置“1”档，因其放大倍率最小，较稳定。第三部分实验记录和实验报告实验记录是实验结果和经验的综合记载，是分析实验结果和书写实验报告的依据。而实验报告是全部实验的根据和总结。两者都十分重要。学生应备有实验记录本和实验报告本一、实验记录1．书写整洁、字迹清楚2．记录实验中观察到的实验现象、实验结果和实验数据。原始记录必须真实、客观、准确、祥细、清楚，切不可夹杂主观因素3．实验中使用的仪器类型、试剂规格、化学反应、分子式及浓度，都应记录清楚4．完整的实验记录应包括日期、实验项目、目的要求、操作和结果等二、实验报告实验结束后，应及时整理实验记录，总结实验结果，写出实验报告。实验报告应包括以下项目：(1)实验名称(2)目的和要求(3)原理(简述实验的基本原理)(4)操作(可以采用流程图的方式或以表格方式表示)(5)结果与讨论描述实验出现的现象和结果，分析它们所说明的问题，探讨实验成败的关键。阐述对实验设计的改进意见等。对于定量实验列出算式进行计算并对实验结果进行必要的说明和分析。(6)思考题实验二蛋白质浓度测定（双缩脲法）【目的和要求】掌握本实验方法的原理和操作掌握标准工作（A—C）曲线的制作熟悉蛋白质定量测定的几种常用方法【实验内容】1．分光光度计的使用2．标准曲线的绘制3．血清蛋白质含量测定【试剂与器材】1．6mol／L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠(NaOH，优级纯)240g，用新鲜蒸馏水配制成1L，置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。

2．双缩脲试剂称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ·5H20)3．0g，溶于500m1新鲜蒸馏水中，加酒石酸钾钠(NaKC4H4O6。4H2O)9．0g，碘化钾(KI)5．0g，待安全溶解后，加入6mol／L氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，约稳定6个月。

3．蛋白标准液可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混合新鲜血清，用凯氏定氮法标定后，加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓度0．5~1．0g／L)，冰冻保存。

4．恒温水浴箱、722（721）分光光度计、吸管、试管、坐标纸【实验原理】测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有凯氏定氮法；比色法主要包括双缩脲法、Folin-酚试剂法及染料结合法；紫外分光光度法等双缩脲(Biuret)法：在碱性溶液中，双缩脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO—NH2)，或与此相似的基团[如—CH2—NH2，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO—NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。【操作】1.配制20g／L蛋白标准液

如蛋白标准液浓度为70g／L，则取此液2m1，加入新鲜蒸馏水5ml，混匀即成。2.按表操作加入物（ml）空白管12345测定管20g/L蛋白标准液～0.10.20.30.40.5～蒸馏水0.50.40.30.20.1～0.4待测样品液体～～～～～～0.1双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.03.0相当血液蛋白质（g/L）～20406080100混匀，置37℃水浴10min(或25℃30min)，用3、标准曲线绘制1—5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。4、实验结果根据测定管吸光度，从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。【注意事项】1．双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比不低于3：1，加入KI作为抗氧化试剂。2．双缩脲试剂要封闭贮存．防止吸收空气中的二氧化碳。3．本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。4．黄疸血清．严重溶血对本法有明显干扰。5．本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线，在100g/L浓度之内呈良好的线性关系。思考题：1．双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其他还有什么方法测定蛋白质的含量?2．请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。实验三醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质(Serumalbuminseparatedbyacetatefilmelectrophoresis）【目的和要求】1．掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作方法了解醋酸纤维素薄膜电泳所分离的血清蛋白质的各带谱及其临床意义。【实验内容】血清蛋白质电泳—醋酸纤维薄膜法仪器和薄膜的准备点样平衡和电泳染色结果判断透明定量分析【器材】1．仪器：电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。

2．材料：醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、剪刀等。【试剂】1．巴比妥—巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06)。称取巴比妥2.21克和巴比妥钠12.36克，溶于500毫升蒸馏水中，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至1000毫升。⑴丽春红S染色液：称取丽春红SO.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀释至100ml。⑵氨基黑10B染色液：称取氨基黑（C22H13O12N6S3Na3）10B0.1g,溶于20ml无水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水杨酸2.5g，溶于少量的蒸馏水中，加入前液将两液混合摇匀，再以蒸馏水补足至100ml。称取丽春红S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸馏水溶解，并稀释至3．漂洗液。（1）3％（V／V）醋酸溶液：适用于丽春红S染色的漂洗。（2）甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml混匀，适用于氨基黑10B染色的漂洗。4．透明液取无水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混匀备用。

5．洗脱液（1）0.1mol/LNaOH溶液：用于丽春红S染色的洗脱。（2）0.4mol/LNaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脱。6．40%(V／V)醋酸溶液。【实验原理】带电荷的蛋白质，在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点不同，但大都在pH7以下，若将血清置于pH8.6的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五条区带，经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。以醋酸纤维薄膜（CAM）为支持介质，电泳分离后经染色处理，可展示出清晰的蛋白质电泳图谱。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比，因此将各蛋白质带剪下，分别用一定量的NaOH稀溶液洗脱下来，即可进行比色，测定出各蛋白质区带的相对含量。也可用一定量的有机溶剂使CAM溶解制成透明膜而用光密度计进行扫描定量。醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。【操作】1、电泳槽的准备将巴比妥－巴比妥钠缓冲液加入电泳槽中（两侧槽内注入等量的缓冲液），调节两侧内的缓冲液，使其在同一水平面，液面与支架的距离约为2～2.5cm。支架宽度到恰好适合CAM的长度，用3～4层滤纸或42、CAM准备取醋纤薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的无光泽面（涂有醋酸纤维素）距一端1.5cm处用直尺和铅笔轻划一线（与CAM的长轴垂直），作点样标记，将膜条编号后将无光泽面朝下浸入巴比妥－巴比妥钠缓冲液中，待充分浸透后取出（一般约需求20～30min）,夹于洁净的滤纸中,吸去多余的缓冲液.3、点样用血清加样器将3－5ul无溶血的新鲜血清均匀地点在划线处，样品应与膜的边缘保持一定距离，以免电泳图谱中的蛋白区带变形。待血清渗入膜后移开点样器。点样应注意，要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。4、平衡将已点样的薄膜加样面朝下，点样端置于阴极端，将膜条紧贴于电泳槽支架的盐桥上并保持平直，桥的另一端垂入缓冲液中，盐桥将膜的两端与缓冲液连通，加上槽盖平衡5min后通电电泳。5、电泳正确联接电泳槽与整流器对应的正负极，点样侧接负极，另一侧接正极。开启电源通电。调节电压10V～15V/cm膜长,电流0.4～0.6mA/cm膜总宽，电泳40－60分钟（通常夏季需45min,冬季需60min），待电泳区带展开3.5cm～4cm时即可关闭电源。6、染色通电完毕，立即取出薄膜直接浸入丽春红S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分钟。7、漂洗至少准备3～4个漂洗皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景漂白为止。此时清晰可见5条色带。待干。7、定量（1）洗脱比色法取六支试管，分别标明“A、α1、α2、β、γ、空白”。将漂洗净的薄膜剪下各区带放入相应的试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，根据染色不同按以下方法洗脱。①氨基黑10B染色洗脱：6支试管于清蛋白管内加入0.4mmol/LNaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振摇数次，置37℃水浴20分钟，使色泽完全浸出。用620nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2②丽春红S染色洗脱：洗脱液用0.1mmol/L氢氧化钠溶液，加入量同上。10分钟后，于清蛋白管内加入40％（V／V）醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氢氧化钠，使溶液色泽加深。如出现沉淀，可离心取上清液比色。用520nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。（2）光密度扫描法1）透明：将已漂净吹干的CAM条浸入透明液中3～5分钟，取出平铺于洁净干燥玻片上（应无气泡），直立片刻除去过多的透明液。于90～100℃烘箱内烘烤5～10分钟，取出冷却至室温。此法透明的CAM2）扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其它光密度扫描的光路，选择波长520nm，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对含量。8、计算定量计算时，先计算各光密度值的总和：再计算血清各部分蛋白质所占的百分率吸光度总和（T）＝2A＋α1＋α2＋β＋γ（吸光度）Ax血清各蛋白组分的相对百分数＝―×100％ATAx表示各球蛋白组分（2A＋α1＋α2＋β＋γ）的吸光度。2AβA％＝――×100％β＝――×100％TTα1γα1％＝――×100％γ％＝――×100％TTα2α2％＝――×100％T各组分蛋白百分数(%)×血清总蛋白g/L各组分蛋白质含量（g/L）＝1009、临床意义（1）血清蛋白醋纤薄膜电泳的正常参考值为：蛋白质组分g/L占总蛋白百分比(%)白蛋白35～5257.0～68.0α1球蛋白1.0～4.01.0～5.7α2球蛋白4.0～8.04.9～11.2β球蛋白5.0～10.07.0～13.0γ球蛋白6.0～13.09.8～18.2（2）临床意义电泳图谱可为临床疾病诊断提供依据。肾病型可见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭等，图型表现为Alb降低，α2和β升高；肝硬化型可见于慢性活动性肝炎、肝硬变等，图型表现为Alb降低，β和γ增高，可出现β与γ难以分离而连接在一起的“β－γ”桥，此现象是由于肝脏纤维增生导致IgA增高所致；急性反应时相型常以α1、α2增高为特征；慢性炎症型则以Alb降低，α2、γ增高较为常见；M蛋白血症主要见于多发性骨髓瘤，病人有大量单克隆蛋白质（主要是IgG或IgA），电泳时可在β和βγ之间出现一条峰形狭窄的区带，称M区带。【注意事项】通电时，不得接触槽内的缓冲液或CAM，以防触电。每次电泳时应交换电极以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换，以使缓冲液的PH维持在一定水平。3．电泳缓冲液的液面要保持一定的高度，过低可能会出现γ球蛋白的电渗现象（γ球蛋白向阴极移动），同时电泳槽两侧的液面应保持在同一水平，否则，通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。4．电泳失败或图谱不理想的常见原因（1）电泳图谱不整齐或蛋白各组分分不佳：点样过多；点样不均匀、不整齐；薄膜过湿，样品扩散；点样速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发；缓冲液变质；电泳时薄膜放置不正，歪斜、弯曲，与电流方向不平行；样品不新鲜；电流过低；CAM质量不好，薄膜结构过分细密，透水性差，导电差等。（2）染色后白蛋白中间着色浅：染色时间不够或染色液陈旧；白蛋白含量过高，可减少血清用量或延长染色时间。（3）电泳速度慢：电流过低；供给薄膜的缓冲液不足，连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄；温度过低；薄膜结构过分细密，透水性差，导电差；缓冲液水分蒸发，致使离子强度增大。（4）薄膜透明不完全：透明液陈旧；浸泡时间不足；烘箱温度未到90℃5．染料问题：各种染料对血清各组分有不同的亲和力，大多数染料对白蛋白的亲和力大于球蛋白。如氨基黑10B对球蛋白的结合力为白蛋白的80％，因此常导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。用丽春红S染色，效果优于氨基黑10B。丽红是一种指示剂，PH＜10时呈红色，PH＞12.5时呈紫色。在酸性溶液中它的最大吸收峰在523nm左右，呈对称性。在血清蛋白正常浓度范围内，丽春红S能与各蛋白质组分成正比例结合，而氨基黑10B则对白蛋白染色过深，区带中容易出现着色不全的小点，不够理想。6．样品要求点在粗糙面（无光泽面），否则样品很难吸入膜内。电泳时最好将点有样品的一面朝下，以防电泳过程中水分蒸发，影响电泳结果。7．标本应新鲜，不得溶血。溶血标本会使β球蛋白假性升高，因血红蛋白电泳位置在β球蛋白区域内。思考题1．血清蛋白在醋酸纤维薄膜上可分成5条区带，每条区带是否分别只代表一种蛋白质?2．用什么方法可证明醋酸纤维薄膜有无电渗作用?3．电场强度愈高血清蛋白在醋酸纤维薄膜上的泳动率愈高，是否电场愈高愈好?附注：电泳技术带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象称为电泳(Electrophoresis)，电泳技术是生物化学与分于生物学中的重要研究方法之一。利用电泳技术可分离许多生物物质，包括氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸及核酸等，并可用于分析物质的纯度和分子量的测定等。电泳按介质状想来分，有自由电泳和区带电泳两大类。前者以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离开来。两者相比较，自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限，而且设备昂贵，操作繁琐，现在已基本上被区带电泳法所取代。所谓区带电泳法，就是在固体支持物上所进行的电泳。50年代以来，常用的固体支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等等。区带电泳法分辨率很高，而且设备简单，操作方便，已经是生物化学及分子生物学领域中极为有用的技术。一、电泳法的基本原理在酸性溶液中，蛋白质分子带正电，而在碱性溶液中，蛋白质分子带负电。伹是这并不是实际的电动单位，从物理化学的原理来分析，带电分子的周围由相反电荷的离子形成扩散双电层，它由紧密层和扩散层两部分构成。紧密层中相反电荷的离子被束缚在大分子周围，它在电场中是随大分于一起泳动的，而扩散层中相反电荷的离子虽然也受到大分子的静电引力，但在电场中却会向另一极移动。紧密层表面相对于溶液本体的电位差称之为电动电位即ζ(Zeta)电位，由它决定了蛋白质分子在电场中的运动速度。蛋白质泳动分子在电场中受到电动力F的驱动，其大小等于净电荷Q和电场强度E的乘积：F=QE如果假设泳动分于为球体，它在电场中泳动时也受到一定的阻力F’，按Stoke定律，其大小与球体半径r，介质粒度刁以及泳动速度成正比：F’=6πrηv当恒速泳动时，电动力F与阻力F’相等，即QE=6πrηv带电粒子在单位电场强度下的泳动速度，称为迁移率(mobility)或泳动度，以μ表示，即：所以可见，一个带电粒子的迁移率不仅取决于其本身所带的电荷，还与带电粒子的大小、介质的粘度等多种因素有关。在具体实验中，式中：v为粒子的泳动速度(厘米／秒或分)，E为电场强度或电势梯度(伏／厘米)，d为粒子移动距离(厘米)，l为支持物的有效长度(厘米)，u为加在支持物两端的实际电压(伏)，1为通电时间(秒或分)。故迁移率(或泳动度)的单位为厘米2·秒-1·伏特-1。假设物质1和物质2在同一电场中移动距离分别为：经过时间t之后，两物质(带电粒于)移动的距离之差力：这就是说，物质1和2能否分离开来，取决于两者的迁移率。若它们的迁移率相同则不能分离，有差别才能分离，差别越大，分离越好。当然，也与其它实验条件有关。二、影响电泳的因素电泳结果可受到多种因素的影响，但通常认为以下4个方面更为重要。(一)电泳介质的pH当氨基酸为被分离物质时，各种氨基酸有不同的等电点，当介质的pH等于某氨基酸的等电点时，则该氨基酸处于等电状态，即不向正极或负极移动，当介质pH小于等电点时，氨基酸呈阳离子状态、向负极移动，反之当介质pH大于等电点时，氨基酸呈阴离子状态，向正极移动。当20种氨基酸的混合物置于pH5．5左右的介质中电泳时，可以将它们分离为三组。蛋白质由氨基酸组成，也具有两性电离性质，所以介质的pH值也影响蛋白质的电离情况，即决定蛋白质的带电量(Q)。为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8．6的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。(二)缓冲液的离子强度离子强度如果过低缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层降低Zeta电势)，使电泳速度减慢，所以常用离子强度为0．02—0．2之间。溶液中离子强度的计算方法如下：Ci=离子的摩尔浓度Zi=离子的价数例1，两个单价离子化合物(如NaCl)的离子强度等于它的摩尔浓度，如0．154mol／LNaCI溶液的离子强度例2，两个两介离子化合物(如ZnSO4)的离子强度等于它的摩尔浓度的4倍，如0．1mol／LZnSO4溶液的离子强度由上述例子中可以看出多价离子会使离子强度增高，所以电泳缓冲液常用单价离子的化合物配制。(三)电场强度实验所用电场强度对移动距离起正比作用。电场强度以每一厘米的电势差计算，也称电势梯度。以滤纸电泳为例，滤纸长15厘米，西端电势差为150伏特，则电场强度为10伏特／厘米。电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。伹电压愈高，电流也随之增高，产生的热量也增加。所以在高压电泳(电场强度大于50伏特／厘米)常需加用冷却装置，否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离，还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多，使支持物(滤纸、薄膜或凝胶等)上离于强度增加，以及引起虹吸现象(电泳缸内液体被吸到支持物上)(四)电渗在电场中，液体对于固体的固定相的相对移动，称为电渗（图2-6）。如滤纸中含有羟基而带负电荷，与纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动。由于电渗现象往往与电泳同时存在，所以带电粒子的移动距离也受电渗影响，如电泳方向与电渗相反，则实际电泳的距离等于电泳距离减去电渗的距离。如方向相同，则实际电泳距离等于电泳距离加上电渗的距离。琼脂中含有琼脂果胶(agaropetin)，其中含有较多的硫酸根，所以在琼脂电泳时电渗现象很明显，许多球蛋白均向负极移动。除去了琼脂果胶后的琼脂糖用作凝胶电泳时，电渗大为减弱。电渗所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心，以观察电渗的方向和距离。三、区带电泳的分类区带电泳的形式繁多，分类比较困难，仅按某一特点分类似乎都不全面。这里基于支持物的物理性状、装置形式、pH值的连续性等不同，可分为：(一)按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为1．滤纸及其他纤维(如醋酸纤维纱、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维)薄膜电泳。2．粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。3．凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。4．丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。(二)按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为1．平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。2．垂直板式电泳，板状支持物，在电泳时，按垂直方向进行，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳。3．连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直，以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸分离血清蛋白质，分离量较大。4．圆盘电泳(discelectrophoresis)。电泳支持物灌制在两通的玻璃管中，被分离的物质在其中泳动后，区带呈圆盘状。如果用石英玻璃制成内径为25或50um、长50—100cm的管状，则成为目前认为比较先进的毛细管电泳技术，若管中注入聚丙烯酰胺凝胶(特殊技术)，也是区带电泳的一种。它集电泳与分析检测系统于一身。因管细、散热快，电压可达2-3万伏，故具有量微、快速、重复性好、分辨率高及可自动化等优点，但价格很高。(三)按pH的连续性不同，区带电泳可分为1．连续pH电泳，即整个电泳过程中pH保持不变，常用的纸电泳，醋酸纤维薄膜电泳等属于此类。2.非连续pH电泳，缓冲液和电泳支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白质时常用这种形式，它的优点易在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的作用。但聚丙烯酰胺凝胶电泳分离核酸则采取连续pH装置。近年来发明的等电聚焦电泳(Electrofocusing)可称为非连续pH电泳，它利用人工合成的两性电解质(商品名ampholin，一类脂肪族多胺基多羧基化合物)在通电后形成一定的pH梯度。被分离的蛋白质停留在各自的等电点而形成分离的区带，电极两端，一端是酸，另一端是碱。等速电泳Isotachophoresis)也是属于非连续pH电泳，它的原理是将分离物质夹在先行离子和随后离子之间，通电后被分主物质的电泳速度相同，所以叫等速电泳。近年发明的塑料细管等速电泳仪，可以进行毫微克量物质的分离，该仪器采用数千伏的高电压，几分钟内即完成分离，用自动记录仪进行检测，它的出现是电泳技术的革新。四、电泳技术的应用电泳技术主要用于分离各种有机物(如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等)和无机盐。也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。电泳技术与其他分离技术(如层析法)结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”就是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果。提高了对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同功酶，对于酶的催化和调节功能有了更深入的了解，所以电泳技术是医学科学中的重要研究技术。下面介绍几个在生化实验工作中常用的电泳技术。(一)纸电泳：是以滤纸为支持物来进行电泳，它常与其它层析方法配合使用，以提高分析效果，纸电泳一般用于物质分离分析、测定等电点、鉴别颗粒电荷的符号和判断样品的纯度等方面。由于纸电泳具有设备简单，化费少以及操作方便等优点，所以目前仍为实验室常用电泳技术之一。然而，纸电泳所用滤纸有较大的吸附力和电渗作用，使样品颗粒泳动易受影响，所以不适用于进行测定迁移率。(二)醋酸纤维素膜电泳。醋酸纤维素是Kohn(1975)首先用于区带电泳，它是由高纯度的醋酸纤维素制成的一种细密而又薄的微孔膜。醋酸纤维素膜电泳的原理基本上和纸电泳原理相同，但由于作为支持物的醋酸纤维素膜对样品的吸附性较滤纸小得多，因此，少量的样品，甚至大分子物质都能得以较高的分辨率。又由于醋酸纤维素亲水性较小，故而电渗作用较纸小，并且它所容纳的缓冲液也较少，因此电泳的大部分由样品传导，可以加速样品分离，大大节约电泳时间。虽然醋酸纤维素膜电泳的分辨能力比聚丙烯酰胺凝胶电泳和淀粉胶电泳等要低，但它具有简单、快速、定量容易等优点，尤其较纸电泳分辨力强、区带清晰、灵敏度高和便于保存、照相等，所以醋酸纤维素膜电泳已取代纸电泳而被广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白’、同工酶等的分离分析，也用于免疫电泳层析技术上。(三)琼脂糖电泳琼脂糖电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳，其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅依赖于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大地提高了分辨能力。琼脂糖凝胶通常制成板状，凝胶浓度以0．8—1％为宜，因为此浓度制成的凝胶富有弹性，坚固而不脆，但是在制备过程中应避免长时间加热。电泳缓冲液的pH多在6-9之间，离子强度最适为0．02-0．05。离子强度过高时，将有大量电流通过凝胶，使凝胶中水份大量蒸发，甚至造成凝胶干裂，电泳中应加以避免。由于琼脂糖电泳具有较高分辨率、重复性好，区带易染色、洗脱和定量以及干膜可以长期保存等优点，所以常用于大分于物质如蛋白费等的分离分析；与免疫化学反应相结合发展成为免疫电泳技术，用于分离和检测抗原。若对目前常用的琼脂糖进行某些修饰，如引入化学基团羟乙基，则可使琼脂糖在6512左右便能熔化，被称为低熔点琼脂糖。该温度低于DNA的熔点，而且凝胶强度又无明显改变。以此为支持物进行电泳，称为低熔点琼脂糖凝胶电泳，主要用于DNA研究。如在分子生物学实验中，用来回收或制备DNA。(四)聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegeldectrophoresis，PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小(1—100微克)、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶，可用于蛋白质，核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。还可结合解离剂十二烷基硫酸钠(SDS)，以测定蛋白质亚基分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理1．丙烯酰胺的聚合聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Act)与交联剂甲撑双烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的西个链通过甲撑桥交链起来的三维网状结构的凝胶。2．聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小决定凝胶孔径的大小主要是凝胶的浓度，例如7．5％的凝胶孔径平均为50A，30％的为20A左右。但交联剂对电泳泳动率亦有影响，交联剂重量对总单体重量的百分比愈大，则电泳泳动率愈小。不管交联剂是以何种方式影响电泳时的泳动率，总之它是影响凝胶孔径很重要的一个参数，为了使试验的重复性较高，在制备凝胶时对交联剂的浓度、交联剂与丙烯酰胺的比例、催化剂的浓度、聚胶所需时间这些影响泳动率的因子都应尽可能保持恒定。要想将一个蛋白质或核酸之类的大分子混合物很好地分开，并在胶柱上形成明显的带，选择一定孔径的凝胶是很关键的。实用中，常按样品的分子量大小来选择适宜的凝胶孔径。3．缓冲系统目前常用的分离胶缓冲系统有三大类：高pH(pH9左右)、低pH(pH4左右)和中性。选择的pH应使蛋白质分子处于最大电荷状态，使样品中各种蛋白质分子表现出泳动率的差别最大。酸性蛋白质在高pH条件下，碱性蛋白质在低pH条件下常得到较好的解离，电泳分离效果较好。假若蛋白质样品经电泳后还希望保留生物活性，则pH值不应过大或过小<大于9或小于4)。在考虑离子种类和离子强度时，原则上只要有导电离子存在的任何溶剂就能用于电泳，但要避免因离子种类和离子强度选择不当使样品中各蛋白质分于之间相互作用而造成人为假象。常选用0．01—0．1mol／L低离子强度的缓冲液。离子强度低，从而电导低，低电导能产生高电压梯度，电泳分离过程短，产生热量较小，分离效果好。4．聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳这里主要简单介绍不连续盘状电泳的基本原理。不连续盘状电泳有较高的分辨力，这里因力有三种效应：浓缩效应，在样品胶和浓缩胶中进行(如不用样品胶，则在浓缩胶中进行)；电荷效应和分子筛效应在分离胶中进行。(1)浓缩效应：管中置三种不同的凝胶层，即上层为样品胶，第二层为浓缩胶，这两层均为大孔胶、Tris—HCl缓冲液、pH值6．7，第三层为分离胶，该层为小孔胶、Tris—HCl缓冲液、pH值8．9。在上下两电泳槽中充以Tris—甘氨酸缓冲液，pH值8．3。这样造成凝胶孔径、pH值、缓冲液的不连续性。在此条件下，HCl几乎全部电离为C1-，甘氨酸有极少部分的分子解离成NH2CH2COO-，一般酸性蛋白质也能解离带负电荷。当电泳系统通电后．这三种离子都向正极移动，根据有效泳动率的大小，最快的称为快离于或先行离子(这里是Cl-)，最慢的称为慢离子或随后离子(这里是NH2CH2COO-)。电泳开始后，快离子在前，在它的后边形成一离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离孑和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，则在快离于和慢离子之间造成一个不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，因此蛋白质样品被夹在当中浓缩成一狭窄层。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。(2)电荷效应：蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分于所载有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个的圆盘区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。(3)分子筛效应：当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，选择分离胶的pH值8．9(电泳时实际测量是9．5)使接近甘氨酸的pKa值(9．7—9．8)，这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此时慢离子的有效泳动率超过所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电压梯度不存在了，各种蛋白质仅仅由于其分子量或构象的不同，在一个均一的电压梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受摩擦力不同、受阻滞的程度不同，表现的泳动率不同而被分开。5．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子型去污剂，当它的浓度在8X10—41'1'10VL以上时，1克蛋白质几乎能够恒定地与1．4克SDS结合。如前所述，蛋白质的迁移率同时与其电荷及大小有关，但由于蛋白质分子这时带有足够的负电荷，如果在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，将由于分子筛效应，它们的迁移率仅取决于分子的大小，因此蛋白质与SDS的结合，必须在蛋白质充分变性的状态下才能达到饱和，因此，这一过程是在巯基试剂(2—琉基乙醇或二硫苏糖醇)存在时加热情况下进行的。例如，天然牛血清白蛋白或胰核糖核酸酶每克只能结合0．9克SDS，将其中的二硫键还原后，便增加到1．4克。糖蛋白中因为糖部分不能与SDS6．聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳蛋白质分子有一定的等电点，当它处在一个由阳极到阴极pH梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与其等电点相同的pH位置上。等电点不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。这种电泳方法便称为等电聚焦电泳。这种方法具有很高的分辨率，可以区分等电点只有0．01pH单位差异的蛋白质，根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量。同时，对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。所以，等电聚焦电泳也是一种得到广泛应用的方法。这种方法的发展取决于pH梯度形成技术的开发。在电场中能够形成pH梯度的物质必须具有以下特性：(1)有足够的缓冲能力，样品存在时也能保持稳定的pH梯度；(2)有足够的电导能力，以使一定的电流能够通过，同时各处都应有相近的电导系数，避免局部地区过热，以及局部地区过大电位差的差异对pH梯度的影响；(3)是小分子的物质，电泳后易于除去；(4)化学组成与被分离的蛋白质物质不同，不干扰测定；(5)不会使蛋白质变性或与其发生副反应。60年代初期，Svesson通过系统研究，确定多电荷的两性电解质满足以上的条件，Vesterberg则进一步选择脂肪族多氨基多羟酸物物质作为介质，在电场中获得了理想的平滑pH梯度。这种物质的商品名称是Ampholine，它实际上是一系列不同等电点的脂肪族多氨基多羧基同系物及异构物的混合物。它是由不饱和酸(例如丙烯酸)与多乙烯多胺加成后产生的，反应式概括如下：④式中Rl及R2是氢或者是带有氨基的脂肪基。由于合成物的不同分子氨基和羧基的比例不同，从而形成连续的等电点。通常的范围有pH3—10之间。等电聚焦电泳可以在液体介质中进行，适宜作大量制备用，每个区带能够聚焦20—80毫克左右的蛋白质。以聚丙烯酰胺凝胶为介质时，设备简单，操作易行，适宜于小量分离及分析。(五)双向电泳——提高电泳分辨率的方法1975年，O’Farrell发展了双向电泳技术，其第一向采用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，第二向采用SDS—凝胶电泳。由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特性来进行分离，因此具有非常高的分辨率。从大肠杆菌溶物中可分析出近1,100种蛋白质或肽链组分，甚至可以判断出一个基团的变异。双向电泳是鉴别蛋白质一项很有力的手段。胶板可以用考马斯亮蓝染色，检出的最低限量为0．3—1微克／斑点。也可以用银染法，检出最低量为2—5纳克／斑点。银离子能与蛋白质的巯基及羧基等基团作用，经还原后显出黑色斑点。为了进一步提高灵敏度，还可应用放射性氨基酸(如35S—甲硫氨酸)作体内掺入，使所有的蛋白质斑点都带有放射性标记，在x—射线底片上曝光后，获得电泳图谱。实验四血浆清蛋白的分离纯化与鉴定（isolation,Purificationandidentificationofplasmaalbumin）【目的和要求】掌握蛋白质的分离技术掌握分段盐析、凝胶层析及蛋白质醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方法掌握电泳方法检测分离效果【实验内容】盐析分段沉淀蛋白质层析脱盐点样、电泳、染色、漂洗观察电泳图谱【试剂和器材】试剂

1．饱和硫酸溶液：称固体硫酸铵85g于100ml蒸馏水中，在70～80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调PH为7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上层液即为饱和硫酸铵液。

2．生理盐水：称取分析纯NaCl0.89克，蒸馏水稀释至1000ml.

3．葡聚糖凝胶SephadexG-25:称取10克SephadexG-25，加入200ml0.02mol/lPH6.5磷酸盐缓冲液溶胀4．10％三氯醋酸。

5．1％氯化钡溶液6．pH8.6，离子强度0.06巴比妥电极缓冲液：称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml。

7．氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B0.5g，用甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml溶解。

8．漂洗液：95％乙醇45ml，加冰醋酸5ml及蒸馏水50ml。器材

1．电泳仪、电泳槽

2．电动离心机、层析柱

3．镊子、培养皿、X光软片、滤纸4．离心管、烧杯、量筒、滴管、小试管、吸管【实验原理】不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。利用硫酸铵分段盐析法将血清中的清蛋白及球蛋白分离，清蛋白液再利用葡聚糖凝胶过滤法除盐，即可得到较纯的清蛋白。纯化后的清蛋白可利用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。盐析：是指将中性盐（如硫酸铵）加入蛋白质溶液中，中和Pr蛋白质表面电荷及破坏水化膜，使蛋白质相互聚集在析出。分段盐析：各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和PH不同，利用不同盐浓度下Pr溶解度不同，将蛋白质分段沉淀下来。半饱和硫酸铵沉淀血清中球蛋白（清蛋白溶解）将血清清蛋白和球蛋白初步分离。常用的除盐方法：半透膜透析；凝胶过滤（层析）。在葡聚糖凝胶层析柱中，由于蛋白质和盐的分子量不同，洗脱速度也不同，大分子蛋白质不能进入凝胶的网孔内而先流出，小分子盐则可进入网孔滞留在凝胶内，收集蛋白洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。用三氯醋酸液鉴定洗脱的蛋白液，以BaCL2检测硫酸铵。纯化后的清蛋白用醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果【操作】盐析沉淀血清球蛋白取离心管1支，加入盐析用蛋白质溶液3ml（血浆1ml和生理盐水2ml），再逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵液3.0ml，充分摇匀。静置20分钟后离心（3000rpm×10分），取上清液（此液中主要含清蛋白）备用。

2．凝胶层析脱盐

⑴装柱：取层析柱（1×20cm）,关紧下端出口，