1-分子克隆解析

将外源（某载体上的水稻）DNA片段亚克隆到另一载体上。第一部分：分子克隆技术pU1301pU1301+1.5KB外源双酶切：

BamHI+KpnIpUC19两种载体的抽提琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量两种载体的限制性内切酶消化目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化载体与外源DNA的连接感受态细胞的制备连接子转化感受态细胞重组子筛选及鉴定分子克隆的主要步骤质粒载体的提取是一个复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增；有1到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)，以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来。载体必备条件质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或表达外源基因的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝数较多，一般在细胞内有20个以上）。质粒的基本特点碱裂解法，主要包括4个步骤：细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期；菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理裂解细胞；染色体DNA、RNA及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的KAC缓冲液处理后离心；质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀。质粒的提取SolutionI: Tris.HCl

（pH7.5） 50mM EDTA 10mM

RNaseA 100µg/mlSolutionII:NaOH 0.2M SDS 1%SolutionIII:Finalconcentration KAC1.32M UsingHACtoadjustpHto4.8TE(pH8.0)：Tris.HCl

（pH8.0） 10mM EDTA（pH8.0） 1mM苯酚/氯仿无水乙醇或异丙醇

碱裂解法用到的试剂SolutionI:重悬细菌;SolutionII:

其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH

使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开;试剂的作用（一）SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。试剂的作用（二）试剂的作用（三）苯酚/氯仿：纯化质粒，去除质粒溶液中残留的蛋白质等杂质；无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNATE或H2O：溶解质粒DNA实验材料携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液；携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。操作步骤取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37℃过夜培养）；用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250r/min过夜培养；吸取1.5ml菌液，12000g离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；加入300lSolutionI振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；加入300lSolutionII，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）；

加入300lSolutionIII颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；12000g离心10分钟；吸取800l上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一个1.5ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；12000g常温离心15分钟；倒尽上清，加500l75％乙醇浸洗除盐，（放置片刻后离心5分钟，弃上清）彻底干燥后加40l灭菌超纯水溶解；质粒的质量检测，-20℃保存。

氨苄青霉素（Ampicillin）：其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成β-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100µg/ml)卡那霉素（Kanamycinsulfate）：核糖体结合，抑制蛋白质的合成（使用浓度：50µg/ml)RNaseA:

C或U的3’－P与相邻的5’－OH处切开RNA。配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于－20℃。试验中用到的抗生素和酶DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。质量检测：琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附近无DNA带（无染色体DNA污染）。质粒DNA质量检测Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1µg/mlHoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1µg/ml，分析范围可延至15µg/ml，但会降低一定的灵敏度。缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。3.DNA的定量（1）荧光检测仪1OD＝50g/ml DS-DNA或

1OD＝40g/ml RNAorSS－DNA（2.）分光光度计琼脂糖凝胶电泳检测将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上；称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；凝胶凝固后，小心拔去梳子；将5µlDNA样品与1µl上样缓冲液和4µl

H2O混合后依次加入点样孔中；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。质粒电泳检测一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）开环线型超螺旋外源DNA克隆的要求特点相同的突出端线状质粒DNA常需用磷酸酶（CIP）处理一般酶切位点常可保留外源DNA会以两个方向插入重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝不同的突出端用两种限制酶消化后需纯化质粒以提高连接效率一般酶切位点可保留,非重组克隆背景低不需CIP处理外源DNA只以一个方向插入重组质粒中末端为平端要求较高的DNA及连接酶不同酶切的平头可连接非重组克隆的背景高质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失（不同平端酶）重组质粒可能带有外源DNA的串联拷贝不同末端克隆的要求及特点限制性内切酶碱性磷酸酶连接酶几种工具酶限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50µl反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1µg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的Star活性：限制酶在极端非标准条件下使用时对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。高浓度的甘油（>5％）；酶过量（>100U/ug）；低离子强度（<25mM）；高pH(>pH8.0)；有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶对上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：注意注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了Buffer和作用的温度等；涉及到酶的操作时,一律在冰上操作；使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取；如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture再分装；各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心。BamHI：

G▼GATTC CCTAA▲GKpnI: GGTAC▼C C▲CATGG含外源DNA片段的载体(M812)（50l反应体系，用1.5mltube，冰上操作）

质粒DNA

30lBamHI(10u/µl) 1lx9=9ulKpnI(10u/µl)

1l

x9=9ul10×buffer 5lx9=45ulddH2O 13lx9=117ul分别取5l

酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果

50

lTotal目的载体（pUC19)的限制性内切酶消化电泳检测MarkerpUC19质粒对照pUC19质粒酶切产物M812质粒对照M812质粒酶切产物点样顺序：2011本科生酶切图片lane1-4,pUC19酶切产物Lane5,pUC19质粒Lane6，M812质粒Lane7-10,M812酶切产物Lane11,DL-2000

marker,12345678910112010学生酶切图片lane1-4,pUC19酶切产物lane5-8,M812酶切产物无marker,无质粒对照1

2

3

4

5

6

7

8造成DNA酶切不完全的主要原因DNA问题：不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；被甲基化；酶切后DNA粘末端退火；识别位点的两侧插入了影响酶切效率的序列；操作不当：酶或DNA粘在管壁上，反应体系没完全混合；酶粘度大，取样不准或酶稀释不正确；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适;酶的问题：活力不够；强烈振荡使酶变性；过度稀释使酶活性降低等。DNA样品中抑制酶活的污染物主要DNA样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性。解决办法：增加酶作用的单位数（10-20U/µgDNA)；增大反应体积以稀释可能的抑制剂；延长反应时间；消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5mmol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物；纯化DNA。酶切反应的终止加入终农度为12.5mmol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应；多数酶在65°C10分钟可被不可逆灭活，少数65°C不失活的酶在75°C15分钟也能失活；若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化。酶切产物的纯化(pUC19)加入ddH2O155l（扩大体积），加入200µl氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后12000rpm离心10min；吸出上清，加1/10体积3MNaAc和两倍体积乙醇，-20℃放置15分钟以上；12000rpm4℃冷冻离心15分钟；倒去上清，用500l

75％乙醇浸洗沉淀；12000rpm4℃冷冻离心5分钟;吹干后DNA溶于10lddH2O。氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤；操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。注意当一个体系中有多种DNA分子，而我们只需要其中的某种DNA时或者反应体系中含有目的DNA以外的其它分子如各种工具酶、dNTPs、引物及矿物油等时，可以利用凝胶电泳分离各种DNA，然后挖胶回收目的DNA带。回收方法主要有：

1.低熔点琼脂糖

2.透析带电洗脱法

3.Glassmilk纯化

4.柱回收试剂盒DNA的回收纯化制1％的琼脂糖凝胶，上样；2-4V/cm的电压下电泳至目的DNA带与引物二聚体及其他DNA带分离开；紫外灯下切下目的DNA带（50－100μl）放入1.5ml试管中；加2－3倍体积6M的NaI溶液(150μl，浸没凝胶块即可)；55°C保温5-10min（不时上下颠倒试管以促进凝胶融化）加2μlGlassmilk55°C放置5－10min；12000g离心30秒－1分钟；弃上清，加300μlwashingbuffer，重悬打匀；12000g离心30秒－1分钟；重复9－10步；弃上清，空气干燥10分钟左右；10μl灭菌超纯水溶解DNA（5μl用于连接反应，5μl用于检测回收效率）。利用Glassmilk从琼脂糖凝胶中回收DNA片段用晶美DNA回收试剂盒从凝胶中回收DNA制1％的琼脂糖凝胶（1×TAE或1×TBE），上样；2-4V/cm的电压下电泳至目的DNA带与引物二聚体及其他DNA带分离开；紫外灯下切下目的DNA带（50－100mg,）放入1.5ml试管中；加3×体积的Bindingsolution(若用TBE胶，加1/2体积的TBEconversionbuffer和4.5×体积的Bindingsolution）；55ºC5分钟（其间摇动管子并快速放回水浴锅）使凝胶溶化加入SilicaPowerSuspension（5µl)，混匀，55ºC5-10分钟；离心5秒，上清转至另一离心管中备暂时保留（回收效率分析）；用500µl冰冷的PreparedWashBuffer重悬沉淀，用移液器或振荡器混匀，离心3-5秒，去上清（若DNA片段≥5kb,用振荡器振荡易打断DNA）；重复洗涤沉淀2次；用水或TE（5µl)重悬SilicaPower/DNA，55ºC5分钟，离心30秒，小心将上清吸取到一新离心管中(不要吸到沉淀）；重复2次，合并上清；检测回收产物。注意切胶时尽量减少凝胶暴露在紫外灯下的时间以避免嘧啶二聚体的形成胶的体积：1g约等于1ml第5步若胶溶化不好：胶尽量切薄一点（2mm)

时间可延长至胶溶化4.2µl的SilicaPowerSuspension可以结合1µgDNA,0.1-2.5µgDNA用5µl足够了，DNA多于2.5µg

时，每多1µg再多加2µl的SilicaPowerSuspension柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA1.通过琼脂糖凝胶将目的DNA带与载体带分开；2.紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA带的胶块放入1.5ml离心管中；（注意：不含DNA的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽量缩短DNA暴露在紫外光下的时间）3.按400µl/100mg胶的比例加入BindingBufferII,50-60ºC水浴中10分钟，使胶融化，每2-3分钟混匀一次；（注意若胶的浓度较大需增加BindingBufferII的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）4.将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，放置2分钟，8000g离心1分钟；5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管内，加入500μlWashSolution,8000g室温离心1分钟；6.重复5步一次；7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管内，12000g室温离心2分钟；8.将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml离心管内，在柱子膜中央加40µlElutionBuffer或水（pH>7.0），室温或37ºC放置2分钟；（提高洗脱温度到55ºC-80ºC有利于提高DNA的洗脱效率）9.12000g室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA片段。注意1.首次使用前，必须在WashSolution中加入4倍体积的无水乙醇，充分摇匀后使用，每次使用后将瓶盖拧紧，以保持WashSolution中的乙醇含量。2.ElutionBuffer为2.0mmol/LTris-HCl,pH8.5.4ºC保存，也可用PH8.0的TE或PH≥7.0的水代替。载体去磷酸化细菌碱性磷酸酶（BAP）,牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）以及小虾碱性磷酸酶（SAP）都能催化磷酸单脂键的水解（包括DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸残基），不能催化磷酸三脂的水解。比较而言，CIAP的活性比BAP的高10－20倍,CIAP经加热处理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不论是BAP还是CIAP还需要经苯酚处理。而SAP经65⁰C加热15分钟就可完全失活。活性定义：在37⁰C、pH9.8的条件下，1分钟内水解对硝基苯磷酸盐（ρ-nitrophenylphosphate)生成1μM的对硝基苯(ρ-nitrophenol)所需的酶量定义为1个活性单位（U）。碱性磷酸酶载体去磷酸化反应体系：DNA 20lCIAP（TaKaRa） 0.5l10buffer 4.0lddH2O 15.5l37℃

或50℃反应30min以上

Total40l去磷酸化载体的纯化加0.4l0.5M的EDTA（终浓度5mM)，75℃水浴10min,使CIAP失活；加入ddH2O150l（扩大体积），加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀后离心10min；吸出上清，加1/10体积3MNaAc和两倍体积乙醇，-20℃放置15分钟以上；12000rpm4℃冷冻离心15分钟；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10lddH2O（0.5mltube中）。载体与外源DNA片段的连接连接酶使双链DNA5’－P与相邻的3’－OH之间形成新的共价键；若质粒载体的两条链都带有5’磷酸基团，则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。连接酶:大肠杆菌连接酶T4噬菌体连接酶各种连接酶特性的比较T4DNA

Ligase

E.coliDNALigaseT4RNALigaseLigasesofthermophilicbacteria最适pH辅酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端可能*不能NODNA5’P末端和RNA3’OH末端可能可能不能NORNA5’P末端和DNA3’OH末端可能不能不能NORNA和RNA少数可能不能可能NO外源DNA 6l(1500bp左右的片段)目的载体DNA 2l(pUC19酶切纯化)10buffer 1lT4ligase(1U/l) 1l连接反应体系16ºC水浴保温过夜Total10l感受态细胞的制备及质粒的转化

转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入受体细胞中的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用酶切、测序等多种方法筛选和鉴定目的克隆。

感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。将外源DNA导入大肠杆菌主要有两种方法CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106～107转化子/gDNA。电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109～1010转化子/gDNA。前夜接种受体菌（DH5），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物于100ml添加有20mMMgCl2的LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；CaCl2感受态细胞的制备（一）4℃下5000rpm冷冻离心8分钟；(收集两次菌体)；弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；4℃下5000rpm冷冻离心8分钟；弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4℃下5000rpm冷冻离心8分钟；细胞重悬用20-50l预冷0.1MCaCl2溶液，可立即用于转化实验；或添加冷冻保护剂（15%～20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。CaCl2感受态细胞的制备（二）操作注意事项密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制，DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；所有操作均应在无菌条件和冰上进行；所使用的器皿必须干净，迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。转化步骤制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中加250lAmp+250lX-gal（显色底物）+25lIPTG（诱导物），混匀后倒入灭菌培养皿中；取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；每组6管感受态细胞分别加DNA连接产物（4管，各10l）、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照，0.1l）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒（注意：勿摇动离心管）；冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；复苏：每管加200lSOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时

即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）。注意：利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。电转化感受态细胞的制备（一）前夜接种受体菌（DH5），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；将菌液迅速置于冰上，同时10%的甘油置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作：吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；4℃下3000g低温离心5-10分钟；电转化感受态细胞的制备（二）弃去上清，加入1500l预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4℃下3000g低温离心5-10分钟；弃去上清，加入750l预冷预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4℃下3000g低温离心5-10分钟；弃去上清，加入20l预冷预冷的10％的甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；超低温冷冻贮存备用（－70℃）。使用的培养基最好用NaCl减半的LB培养基；密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制，DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；制备感受态细胞及配制试剂所用的水应达到18MΩ，即使用超