微生物分子生物和分子生态学基本操作

微生物分子生物和分子生态学基本操作手套原则上不论什么实验都应带手套操作特别是无菌操作；与RNA有关的所有操作；重要克隆菌的挑单克隆，扩增，保存等与有毒试剂有关的所有操作，比如染胶时的EB；提取用的有机试剂（通风橱）；Pipett量程:使用合适量程的枪(移液器)校对:定期使用:一定在合适量程范围内使用;枪头必须插紧,防止脱落以及吸样体积不够;用第一档吸样,打出样品到第二档;

吸样时防止倒吸;不要水平放置带有枪头的枪;使用后挂在枪架上,不可以乱放枪头带手套装枪头灭菌外包报纸灭菌后50-70度烘干后使用带手套0.1to10ulclearTips0.5to10ulClearTips1-200ulclearTips1-200ulYellowTips(UniversalFit)1-200ulClear,graduated(UniversalFit),1-200ulClear,Non-Beveled1-200ulYellow,Non-Beveled1-200ulClear,Extra-Long100-1300ulBlueGraduatedTips100-1000ulTips,fitGilsonLTSPipetor0.1-10ulSterilizedMicro-filterTips加样-使用合适的枪与枪头比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clearTips它不会有残留；如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear,Non-BeveledTips（或将一般枪头去尖头）；与RNA操作有关的枪头最好为SterilizedMicro-filterTips，或者至少为用DEPC水处理的枪头；加样体积应为枪头最大体积的20%-100%，低于该范围的用小一号的枪头；大于该范围的可以用同样的枪头加样两次（两次体积相当，比如加210ml,可以用200ml枪头以105ml加两次）；加样加用任何试剂前要将试剂混合（除饱和酚，或一些特别的有机试剂）加样的枪头应在试剂的中间表层吸收，防止枪头外壁带用过多试剂，改变加样实际体积（除饱和酚外，一定要伸到tris饱和液下的酚中）加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从反应体系的管底吸上，反复吹打多通道枪混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀;多数分子操作在加样后、反应前都要充分混匀二、旋涡混匀器

0.5-1.5ml管15%-40%体积时;试管30%体积以下，一、枪混匀0.2ml管,0.5ml管15%体积以下三、手动混匀:颠倒混匀:0.5-1.5ml管30%-70%体积时,试管30%-70%体积;擦边混匀:0.2-0.5ml管30%体积以下水浴提前10-30分钟调好温度;稳定后才能使用;水位不可以低于水浴锅高度的50%用合适浮子;定时;使用后需要添水或换水关闭电源离心离心前，如果需要预冷，至少预冷15分钟。盖好管盖，充分混匀；质量对称放置；不合适的离心管应外套其他型号的管子；如离心0.2管，最好是放在0.5管套1.5管中；如短暂离心可以放在1.5管中；盖上离心机的内盖离心后，如果要移动，放在试管架上移动，防止破坏液面；短暂离心要在3000-8000rpm范围内；时间应短于30秒；如果离心机被有机试剂或其它样品污染当事人应及时清理细菌DNA的提取

环状双链DNA、不与组蛋白结合（古菌具有组蛋白类蛋白）、基因总数水平一般为103-104，一般情况下，一个细胞中只有一条染色体或一套基因组。TheE.coligenomeisacirculardouble-strandedmoleculeofDNA;thisDNAmoleculeis4,639,675basepairsinlengthandencodes4267genes.DNA的提取过程就是用化学和物理的方法，使DNA与其他细胞物质分离开来的过程。一般本实验室采用的有高盐法，CTAB法，煮沸法。本次实验采用SDS高盐沉淀法。菌株划LB平板活化，挑单菌落，接3ml试管，于30℃剧烈振荡培养过夜至稳定期。离心收集菌体1ml，然后用等体积TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于等体积TEN中。加入200ul溶菌酶（100mg/ml），37℃水浴1h，再加入300ul20%的SDS，37℃水浴至溶液澄清。**加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡，12000rpm离心10min。我们的实验中上清就取1ml,以方便后续实验。上清用等体积酚抽提1次，12000rpm离心10min，小心地吸取上清。上清再用等体积的酚：氯仿抽提1次，12000rpm离心10min，收集上清。上清再用等体积的氯仿抽提1次，收集上清。上清中加入等体积TE（稀释调整NaCl浓度），0.6倍体积异丙醇沉淀，12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于100ulTER中，取1ul电泳检测，其余的-20℃保存备用。琼脂糖凝胶电泳

和凝胶成像实验步骤凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料:

琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断；聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。1、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静，注意样品不能混样。2、实验步骤

⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。⑵将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固。⑶充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。⑷用移液器吸取总DNA或质粒样品xμl于一次性手套上，再加入一定量的6X/10Xloadingbuffer，混匀后，小心加入点样孔。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。⑸打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min：当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳。⑹将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。质粒DNA的存在形式有3种：①共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；③线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA>线状DNA>ocDNA。原质粒酶切后质粒ocDNA线状DNAcccDNA（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。3、琼脂糖电泳的优点配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.1kb～60kb范围内的DNA片段琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围

常用的电泳缓冲液4℃保存备用.常用的6X载样缓冲液Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液

Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液二、凝胶成像

1打开凝胶成像仪电源（机器后部），开电脑；

2将染色后凝胶用水冲洗后，将凝胶放在透射板正中，并关严暗仓门，打开紫外灯；

3打开Quantityone软件，点击basic，File中选择

GetDocEQ…，调节使图象到达合适亮度、大小及清晰度；

4待图象最优化时，成像freeze在屏幕上，关闭紫外灯，点击“Save”保存；

5关闭软件；

6打开暗仓门，拉出透射台，凝胶丢弃至专门垃圾桶，插掉透射板上水迹；

7关上暗仓门。1、具体步骤2、QuantityOne软件是TheDiscoverySeries软件家族的成员，它是一个功能强大的灵活软件包，可成像和分析一维电泳凝胶、斑点印迹、狭线印迹和菌落计数。Q