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文档简介

四、基因突变与蛋白质工程基因突变

基因组DNA分子在结构上发生碱基对中组成或顺序的改变，并引起个体表型的改变，而使生物体发生遗传性变异。蛋白质工程

蛋白质设计或蛋白质工程是指用遗传方法修饰蛋白质序列。基因突变引起基因突变的原因

物理因素化学因素生物因素突变剂、自发突变与诱发突变基因突变的分类按照突变过程

自发突变诱发突变按发生的细胞种类

生殖细胞突变体细胞突变基因突变的分类从对三联体密码基对遗传信息的改变来分

同义突变错义突变无义突变按照DNA序列的改变情况

点突变碱基插入突变碱基缺失突变移码突变突变技术随机突变区域随机诱变点突变寡核苷酸介导的点突变

PCR定点突变随机突变寡核苷酸介导的点突变-寡核苷酸

引物诱变

诱变技术的原理

使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸段片段作引物，启动单链噬菌体M13进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，新合成的子链便具有发生突变的碱基序列。诱变程序退火合成全长互补链封闭缺口转染突变体筛选、鉴定和回收用核素标记的诱变剂寡核苷酸作为探针进行杂交筛选该探针同野生型DNA之间存在错配碱基，在漂洗时易解离，而与突变DNA之间形成的杂交体不发生解离先测序无误后，从噬菌体基因组双链复制型中回收外源DNA，然后将突变的片断取代野生型DNA同源片断，并通过适当的方法测定突变的表型效应同源重组机制寡核苷酸介导的点突变-盒式诱变

以各种双链质粒DNA为载体，利用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段置换待改造基因中两个限制酶切位点之间的序列，在转化的大肠杆菌中形成数量众多的的突变体。PCR点突变引物PCR定点突变法重组PCR定点突变法引物PCR定点突变法原理

以第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的大引物，故又称大引物PCR诱变法。优点

简便、产生错配的机会很小重组PCR定点突变法原理

采用目的突变的寡核苷酸引物，以靶基因的质粒为模板，由PCR产生的同源DNA末端在E.coli通过体内重组，产生具有目的突变的同源DNA末端的DNA片段，转化后在菌体内重组成环状并携有点突变序列的质粒。点突变技术的应用在分子生物学和基因工程中的应用在蛋白质工程上的应用（1）提高蛋白质的生物活性和稳定性（2）减低多肽产品的毒性作用（3）改变亚型和种属特异性（4）增高蛋白质作用的专一性已知编码基因结构或结构模型已知随机诱变（易错PCR，基因改组）改良的突变体的计算机模型位点特异性突变通过分析进行实验验证重复循环几次重复循环几次蛋白质工程蛋白质工程举例酶方法突变影响洗涤剂蛋白酶理性设计222met→ala对氧化作用稳定人胰岛素理性设计22lys→pro降解变慢组织纤溶酶原激活剂理性设计缺失k

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