干细胞基础与临床应用基础研究

干细胞基础与应用基础研究广西医科大学研究生选修课课程组胚教研室陈维平干细胞基础与临床应用基础研究内容安排一、理论课1、细胞体外培养基本技术和方法讨论2、干细胞的分离与培养3、胚胎干细胞4、成体（组织）干细胞5、讨论交流二、实验课1、干细胞的分离、培养与观察三、考核内容：设计一份完整的“XX干细胞培养的基本方法（流程）”时间：2014年1月干细胞基础与应用基础研究干细胞基础与临床应用基础研究干细胞基础与应用基础研究（一）

细胞体外培养

基本技术和策略讨论干细胞基础与临床应用基础研究（一）基本概念1体外培养(Invitroculture)对象：细胞（特定条件下、单一细胞成份）组织器官胚胎（全胚培养Holo-embryoculture）条件：体内生存环境的模拟（天然优化环境～人工环境）目的：1、建立活体结构成分在体外生存、生长的适宜环境

2、应用干细胞基础与临床应用基础研究（一）基本概念2体内培养(Invivoculture)方式：移植（Transplantation）条件：异体相似环境优点：最大限度模拟自然生长环境目的：分化研究、临床治疗、特殊目的（如珍贵细胞株污染的处理）干细胞基础与临床应用基础研究（二）基本条件（模拟）营养条件的模拟

水：无机盐：葡萄糖：维生素：氨基酸：细胞因子(Cytokine)：未知因素理化条件的模拟温度：液体渗透压：氧与酸碱度：细胞之间的相互关系：培养基的选择干细胞基础与临床应用基础研究一、水细胞及机体内环境～溶解或分散状态离子和/或分子的水溶液（化学基础）水的重要性质：惰性～大多数物质溶于水而不发生化学反应。热稳定性和导热性。表面张力等等：表面张力是维持细胞形态的重要条件。干细胞基础与临床应用基础研究二、无机盐存在形式：离子状态为主结合（蛋白质或脂质）形成与维持培养液的晶体渗透压对细胞功能活动的支持作用细胞和组织类型不同，对无机盐的要求也不同实验目的不同，对培养基中无机盐的要求也不同实验步骤的目的不同，对培养基中无机盐的要求也不同干细胞基础与临床应用基础研究三、理化条件1温度：35～37℃细胞对低温耐受能力强过高温

1、应该对实验有全过程的考虑

2、高温的结果是一样的

3、低温条件下细胞活动减缓至停止

4、对低温的耐受能力与细胞类型、个体年龄等因素有关

5、低温的危害与细胞内外冰晶形成的不均衡有关，故降温应该是缓慢的，避免冰晶形成；复温应该是快速的。液体渗透压：正常血浆280～310mOsm/kg；（主要由晶体渗透压构成胶体渗透压〈1.5mOsm/kg）酸碱度：7.36～7.44耐受范围6.0～8.0；干细胞基础与临床应用基础研究三、理化条件2细胞之间的相互关系：1、从组织水平的认识细胞是结构和功能的基本单位，而组织是细胞的存在形式。2、从细胞水平的认识

a.直接接触型；膜表面分子结合

b.直接联系型；胞间间隙连接

c.间接联系型；生物因子传递干细胞基础与临床应用基础研究三、理化条件3生长基质（Groundsubstance）：大多数机体内的细胞不是生活在液态环境中的，体外培养环境下表现为贴壁、附壁生长，培养器皿的表面不适合细胞的这一特性，必需包被某些物质，以帮助细胞贴壁、附壁生长。

1、多聚赖氨酸(Polylysine)0.05mg/ml2、纤维连接蛋白(Fibronectin)3、胶原（如鼠尾胶）

4、层粘连蛋白(Laminin)5～10μg/ml干细胞基础与临床应用基础研究四、培养基的选择1一、基本概念培养基(Nutrientmedium)：多指商品，固态或粉剂，未经溶剂溶解的状态。培养液(Culturesolutionmedium)：用溶剂溶解后的溶液，一般添加有血清、抗生素、活性因子等等。条件培养液(Conditionedmedium)：经过某些细胞培养，含有特定的（已知或未知）细胞分泌物的培养液。参考文献只能提供基本的参考，除重复性实验外，具体的实验方案应该从多个角度来综合考虑，必要时还应该做探索性实验。干细胞基础与临床应用基础研究二、常用类型天然培养基：血清、胚胎渗出液、水解蛋白合成培养基：RPMI1640、EagleMEM系列（BME、DMEM、IMEM、αMEM）、HamF12。无血清培养基：化学成分确定的培养基，对实验目的和细胞类型的针对性强。

1、基础培养液：DMEM∶HamF12=1∶12、附加成分：根据实验目的、细胞类型等因素设定。如B27、N-2，针对神经元；G-5，针对神经胶质细胞四、培养基的选择2干细胞基础与临床应用基础研究（三）基本步骤

取材：目的明确、取材准确、避免过多的损失和损伤。分离:制作细胞悬液。纯化：提高目的细胞富集度。原代培养：目的细胞在体外条件下的生长、扩增。传代培养：进一步扩增、纯化。鉴定：定质、定量。冻存与复苏：保存

连续传代培养干细胞基础与临床应用基础研究一、取材1（一）、实验的目的：

直接影响实验各环节，如培养基的选择、培养时间的长短等等。

取材是整个实验的重要步骤之一，决定了后续实验步骤的效率。干细胞基础与临床应用基础研究一、取材2（二）、细胞及其所在组织的性质：帮助确定分离的方法、消化酶的选择与使用等等。（三）、操作流程的优化：

应该充分考虑保持细胞活力：操作时间短、细胞损失和损伤少。干细胞基础与临床应用基础研究一、取材3细胞悬液(Cellsuspension)：单个细胞存在于溶液（培养液、平衡液、缓冲液等）。一般程序：１、解剖充分暴露、洗涤、剔除多余组织。２、分割1mm3植块植块培养３、分离（散）细胞机械解离、酶消化、鳌合剂解离。４、筛网过滤５、低速离心500～800r／m

5～10min

800～1000r／m

5～10min６、计数、调节细胞密度105个／ml

干细胞基础与临床应用基础研究二、分离与纯化1分离与纯化在概念上没有明确的区别，也不是一个单一的、独立的步骤，往往贯穿在整个细胞培养的过程之中。分离与纯化是衡量细胞培养成功与否的重要标志；也是建立细胞系（细胞株）的前提。1、细胞分离（Separation）：从组织材料、细胞悬液中获取目的细胞。2、细胞纯化（Purification）：从异质性的混合物中获得单一类型细胞。3、富集（Enrichment）：分离纯化后，目的细胞数量所达到的比例。干细胞基础与临床应用基础研究二、分离与纯化2（一）基本原理1、根据细胞的物理特性，如密度、电荷等。2、根据细胞的生物学特性，如贴壁紧密程度、贴壁快慢、特异性表面标志等。3、根据其它细胞特性（二）基本方法1、机械分离与酶学分离2、基于物理性状的分离纯化技术、速度沉降法3、根据细胞表面电荷的分离方法4、利用细胞表面标志的分离方法5、根据其它细胞特性的分离方法干细胞基础与临床应用基础研究机械分离与酶学分离11、取材过程中的分离

尽可能剔除其它结构、组织。充分冲洗，必要时可考虑添加抗生素。2、筛网过滤根据组织、细胞的类型，细胞大小来选择筛网的材质、孔径大小3、酶学分离对同一种组织，采用不同的酶消化，细胞富集的类型也不同。举例：对皮肤消化胰蛋白酶？胶原酶？干细胞基础与临床应用基础研究机械分离与酶学分离24、培养过程中的选择性体外培养过程中的自然法则：

a、富集多、活力强、增殖能力强的细胞类型会表现出优势生长。

b、细胞集落可以出现区域性分布。方法：机械性刮除、选择性消化目的：清除或收集干细胞基础与临床应用基础研究基于物理性状的分离纯化技术1优点：无需对细胞进行复杂的（化学、生物学等）处理，避免了细胞发生变化，对细胞的活力影响较少。关键：1、密度梯度形成介质的选择。

2、密度梯度的配置。也称为密度梯度离心（Densitygradientcentrifugation）技术沉降速度=离心力细胞体积细胞密度和介质密度差/介质黏度干细胞基础与临床应用基础研究介质选择的原则：

1、密度范围大包括所需要的密度。

2、溶液的黏度低较小离心力和较短离心时间可达到分离效果

3、易于测定其密度（浓度）。

4、不损伤细胞、不改变细胞生物学特性。

5、离心分离后易于除去。

6、不妨碍、不影响后续实验研究的目的。基于物理性状的分离纯化技术2干细胞基础与临床应用基础研究基于物理形状的分离纯化技术3

常用介质1、血清白蛋白早期常用，但黏度太高。2、聚蔗糖（Polysucrose）即Ficoll，实验室常见，缺点是：黏度、渗透毒性随浓度增加而增加。使用时注意避免。3、泛影酸盐常用的“淋巴细胞分离液（密度：1.077±0.001g/ml）”就是泛影酸盐和Ficoll配制而成，以避免Ficoll黏度、渗透毒性随浓度增加而增加的缺点。干细胞基础与临床应用基础研究基于物理形状的分离纯化技术4

常用介质4、硅胶颗粒Percoll（密度：1.13±0.005g/ml）

优点：（1）稳定性好。可长期保存。（2）密度稀释范围大，包括了大多数细胞密度。（3）溶液产生的渗透压小，全密度范围内维持等张。（4）黏度低，较小离心力和较短离心时间可达到分离效果。（5）易于洗涤清除，对细胞无毒性。（6）高速离心时可形成连续密度剃度。（10000r/min）（7）用量少，经济。干细胞基础与临床应用基础研究基于物理形状的分离纯化技术5

常用方法1、一步密度梯度离心法高密度介质、低速离心依据细胞的密度和体积:密度大于介质的在介质之下；密度小于介质的在介质之上体积大的沉降速度快；体积小的沉降速度慢。注意：对不同物种的细胞，分离介质的密度稍有不同。干细胞基础与临床应用基础研究基于物理形状的分离纯化技术6

常用方法2、等密度梯度离心法依据细胞的密度

a、连续密度梯度：密度逐渐增高的介质体系

ρc=ρm时，沉降速度为零，细胞停留在密度相同的介质区带内。

b、不连续密度梯度：密度递减、顺序、分层分布介质体系，时细胞停留在

ρm1〉

ρc〉ρm2的界面上。干细胞基础与临床应用基础研究基于物理形状的分离纯化技术7

常用方法3、速度沉降法依据细胞的密度和体积，但以体积为主要因素。

a、单位重力速度沉降法：单位重力作用，低密度介质（BSA+0.01mol/LPBS，梯度：1.0099～1.0123g/ml）优点：细胞回收率高、重复性好、分离量大。缺点：时间太长（数个小时！！！），细胞活力易受影响。

b、低速离心速度沉降法：

5%～20%Ficoll，100g，25min的条件下。干细胞基础与临床应用基础研究根据其它细胞特性的分离方法1一、反复植块培养法原理：不同的细胞从植块中迁移出来的时间、速度不同。优点：细胞在取材时受损伤少缺点：纯化周期长，细胞纯度低，细胞产量低。植块雪旺细胞成纤维细胞成纤维细胞第一周第二周第三周干细胞基础与临床应用基础研究根据其它细胞特性的分离方法2二、有丝分裂抑制剂法原理：有丝分裂后细胞（不再分裂增殖的细胞，如神经细胞）不受有丝分裂抑制剂的影响，可分裂细胞明显受其抑制逐渐消亡。常用抑制剂：

阿糖胞苷（Ara-C）、氟尿嘧啶（FU）干细胞基础与临床应用基础研究三、原代培养1原代培养的概念：1、是指“初次培养”的含义，没有培养物的分割。2、“代”只是分割的记录与记数形式，与细胞分裂增殖的“代”不同。3、植块培养也可以分割，故也可以进行传代培养4、更换培养液、更换培养器皿，仍是原代培养。干细胞基础与临床应用基础研究三、原代培养2基本目的：1、维持目的细胞在体外条件下生存一段时间,适应体外培养的新环境。2、更接近原来的组织形式，有利于目的细胞适应体外培养的新环境。3、使目的细胞在体外条件下稳定生长、扩增，形成优势群体。干细胞基础与临床应用基础研究三、原代培养3植块培养植块培养目的：1、观察组织生长行为及其规律。2、获得向外迁移的细胞（应该有相应的松解、离散措施）。植块培养的优点：保持了良好的3D组织结构、维持了细胞之间的相互作用，细胞易于成活和生长。植块培养的缺陷：植块中央的物质交换受局限。适宜大小！1mm3植块培养的关键：1、植块的贴壁、固定。2、培养液的添加。3、如果是为了获得细胞，要注意植块的适时移出。干细胞基础与临床应用基础研究三、原代培养4细胞培养优点：能在特定条件下，获得单一类型的细胞并进行相关的研究。关键：使细胞尽快进入分裂、增殖的生长状态。

1、促进细胞贴壁

2、适宜的细胞接种密度。

105个/ml是常用的标准，但还应该考虑细胞类型、生长能力、活力。

干细胞的培养会选择更低密度？干细胞基础与临床应用基础研究三、原代培养5培养空间3、培养空间构建适宜的培养体系：培养体系由两大部分组成：液相和气相调整培养空间的目的：保证细胞的供O2量相关参数：（1）、液相∶气相=1∶10（体积）（2）、液相高度：2～5mmO2O2O2干细胞基础与临床应用基础研究四、传代培养1传代的目的：1、避免接触性抑制，保持细胞稳定地生长。2、进一步纯化细胞类型。（1）不同的传代处理方式（2）不同的处理强度传代的指标：1、体细胞：集落占据80%～90%的瓶底面积。2、干细胞：根据目的细胞集落的生长状况，有必要时。干细胞基础与临床应用基础研究四、传代培养2传代的基本步骤：1、换液一些技术手册要求传代前一天换液，主要是改善细胞状态，增强适应能力。2、解离细胞目的细胞的生物学特性决定解离细胞方法酶消化法机械震荡法3、再次接种传代的关键：1、适当的时间2、适当的方法3、适当的细胞密度干细胞基础与临床应用基础研究五、“二倍体细胞”的问题细胞性状的稳定，是体外培养条件下，研究体内细胞生物学性状的前提。问题：在较长时间和不适宜条件下的体外培养，由于细胞融合等已知和未知的原因，细胞的染色体倍数会发生变化，成为多倍体细胞。营养条件理化条件生活环境遗传物质基础传代干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察1

在体外培养条件下，细胞的生长行为会有相应的变化，对其研究的目的是：

1、了解细胞的生长行为的基本规律；

2、区分质变与量变，判断目的细胞的价值和意义。A、体外培养细胞的生长方式：

1、黏附型

2、悬浮型干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察2黏附型细胞黏附是体外培养条件下恢复“组织形式”的倾向

1、细胞与细胞之间的接触

2、细胞与细胞外基质结合体内、体外的差异：体内是立体三维的结构；而体外只是二维的空间，大多数情况下只有一个附着面。故细胞的外形会有变化。干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察3黏附型细胞的类型：1、上皮型细胞（上皮样细胞）：细胞镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”；起源于内胚层、外胚层的细胞多呈此型。干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察42、成纤维细胞（成纤维细胞样）：细胞梭形、多角形、胞体铺展，细胞间隙较大，细胞排列疏松；细胞可呈放射状、螺旋状排列。起源于中胚层的细胞多成此型。干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察53、多形型细胞细胞有较长的突起、胞体多角形，可分为胞体部和突起部，细胞间距大。常见类型：神经组织细胞。干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察64、游走型细胞：细胞分散、不易形成集落；可有胞质突起，细胞变形、游走活跃。见于单核吞噬细胞系统、肿瘤细胞。干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察7铺展：球形原饼形

细胞铺展

极性细胞铺展的程度与细胞DNA合成、细胞的生长有密切关系。内质外质干细胞基础与临床应用基础研究六、体外培养细胞的生长与观察9B、每一代细胞的生长过程：1、潜伏期：2、指数生长期：3、停滞期：123接种细胞数量培养时间干细胞基础与临床应用基础研究关于“隔天换液”的辨析：细胞周期（cellcycle)：

是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段根据细胞的分裂能力可把它们分为三类：①增殖细胞群，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环；②不再增殖细胞群，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（endcell）；③暂不增殖细胞群，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，