白血病细胞免疫表型流式细胞仪史桂英

白血病细胞免疫表型流式细胞分型技术及意义（FlowCytometer）

SSMUShiGuiYing分析细胞学FALSSensorLaser细胞的形态学参数生物学特征细胞化学成分及含量细胞的功能定量分析细胞学年青的交叉学科

激光技术数字计算机技术电子物理技术电子摄像技术光电测量技术荧光细胞化学技术单克隆抗体技术等FCMHistory1934Moldavanlfirsttry（从固定式细胞分析-流动式）1953Crosland-Taylor:laminarflow（解决难题）1956Coulter（初次应用）1965Kamentsky:spectrometerprinciple(Ortho（开拓）1967VandillaandLosAlamosgroup:Feulgen,DNAHistogram（完善）1969Hulett:Sorter(Icp-22)1973B-D:FirstcommercialFCM--FACSI（发展）1979SSMU:FCMDeveloping（推广）1980BJNU:FirstFCM(FACSIII)inChinaAbout450FCMsinChina1979年国家科委重点项目：研制国内第一台激光流式细胞仪1982年国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生1984年国家科委组织科研成果的鉴定验收1985年获国家卫生部科技成果乙等奖1985年--1990年灵敏度、信噪比、更多参数流式分选仪研制开发计算机四参数软件样品制备、医学生物学应用BD公司不同型号流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCantoCoulter公司不同型号流式细胞仪EPICSXL/XL-MCL

台式机

CytomicsTMFC500系列最新型EPICSAltra细胞分选仪大型科研型

什么是流式细胞术(FCM)？

FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。FALSSensorLaser特点:

流动的可以是活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞

FCM的一般结构和原理速度轨迹检测散射光荧光InjectorTip荧光信号激光束Sheathfluid流动室2-3mm方形石英内径直200-300m

流速慢,细胞信号大,小型化。通过流动室后细胞一个一个排列成单行,依次通过检测区.把流动室称为单细胞流发生器.流动室LaserFlowCell孔径50-200m

检测区离喷口200m有分选功能

液流驱动系统（示意图）流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。

FACSVantageFluidSystem激光（Laser,Lightamplificationbystimulatedemissionofradiation)是一种相干光源。单谱线，高强度.

细胞在1-2us内就可以收集到足够强的荧光信号.一般采用Ar+激光器,有多条可调谱线,与多种荧光染料激发谱匹配.激发光源与光束成形系统

球透镜和柱面透镜：20×200m

椭圆形光，短轴和细胞流平行，长轴与细胞流垂直。

光束成形与细胞受照方式激发光焦斑这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照

FCM的单细胞照明技术.光束成形与细胞受照方式低速高速

不同样本速率形成的样本流

LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系统：滤光片信号转换系统:光电数字信号.FCM细胞分选装置488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFSCSensorFluorescencedetector

超声振荡器:20-40KC液流断离点:离喷口5-8mmf=v/4.5d液滴冲电:脉冲幅度,荷电多少,宽度大小同时带电液滴数多少.静电高压偏转板:几千伏电压分选细胞的收集装置:96孔板,载玻片或试管利用单克隆抗体分离细胞亚群阳性选择阴性选择MACS-MagneticCellSorting磁珠分离通道式分选电荷式分选细胞分选系统PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

细胞信号检测与分析处理系统光电管细胞散色光的波长是与激发光波长一致的.前向散色光信号:光电二极管侧向及荧光信号用光电倍增管PMT可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号,电脉冲信号通过模数转换器(ADC)量化为数字信号.FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter(FSC)细胞散色光信号细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.90DegreeLightScatter(SSC)FALSSensor90LSSensorLaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.FSCFSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关SSCSSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关细胞散色光信号细胞荧光测量细胞的自发荧光

未经染色的样品细胞在激发光的照射下可测到有微弱的荧光信号.细胞荧光

经过各种特异染色的细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光信号.自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号特异染色的荧光信号细胞荧光信号AMPAMP

经过PMT将光学信号转变为电脉冲信号，并增加PMT的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种：线性放大(Lin):对数放大(Log):荧光信号的测量：

荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长

线性放大对数放大细胞荧光信号荧光光谱重叠

FITC和PE荧光光谱重叠

UncompensatedvsCompensatedFL1FL2利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”荧光补偿FCM测量数据的存贮、显示和分析（一）FCM数据的存贮（二）FCM数据的显示方式（一）FCM数据的存贮

ListMode方式就是用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件。1.单参数直方图（Histogram）2.双参数数据显示：

二维点图(DotPlot)

等高线图(ContourPlot)

二维密度图(DensityPlot)

假三维图(Pseudo3DPlot)3.三维图(3DPlot)（二）FCM数据的显示方式１.单参数直方图的显示

以分布直方图(distributionhistogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。Single-ParameterHistogramDisplays单参数直方图的显示２.双参数数据的显示

细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图(DotPlot)。在二维图上，X轴代表第一个测量参数，Y轴代表第二个测量参数。每个点代表一个细胞.Two-ParameterDataDisplays点图(dotplot)二维等高图

用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。假三维等高图

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。３.多参数数据的显示

在单一图上同时显示多参数是不可能的。实际工作中是用若干个单参数直方图和各种不同组合的双参数数据显示来反映各种信息的。多参数测量另一重要意义是通过有关参数进行“设门”分析(gatinganalysis)可以是单参数设门，也可以是双参数设门。单参数设门调出双参数显示简称“一调二”。不难理解也有“一调一”和“二调一”和“二调二”等。Multiple-ParameterDataDisplays多参数直方图

三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。多参数显示

一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。Pseudo3DPlot3DPlot多参数显示通过双参数调阅单参数通过单参数调阅双参数１.单参数分布直方图的设区分析２.细胞DNA含量分布直方图的数据分析３.双参数数据的设门分区分析４.多参数数据的分析FCM数据的分析１.单参数分布直方图的设区分析细胞DNA含量分布直方图的数据分析细胞DNA含量分布直方图的数据分析DNA分析比较

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞双参数数据的设门分区分析双参数数据的设门分区分析正常造血细胞分化成熟的抗原表达正常造血细胞不同阶段的抗原表达是受一系列基因严密控制的,在一定的分化阶段哪些抗原表达上调、哪些抗原表达下调及抗原表达量多少存在着明显的规律性.一部分白血病细胞反映了这种分化模式,但白血病细胞经常出现异常的抗原表达模式.这些异常的抗原表达模式可以作为诊断白血病的有用指标,也可以作为检测残存白血病的重要指标.FCM白血病细胞免疫表型诊断I:粒细胞表达CD34HLA-DRCD13CD45较高水平的CD33,不表达成熟标志.II:CD34HLA-DR下调变为阴性,CD15高表达CD33轻度减低,CD13/CD45不变.III:出现中水平CD11b,CD13减弱,CD33与II相同,CD45阳性.IV:CD13增强,出现CD10,CD33进一步减低.CD11b和CD15表达增强.V:CD11b、CD13、CD45表达最强,CD15阳性,CD33弱阳性.分选出:I为原粒细胞II早幼粒细胞III中幼粒细胞IV晚幼粒细胞V中性分叶核粒细胞分选出:I原单核细胞II幼单核细胞III成熟单核细胞I:表达中等程度的CD34CD13CD45CD33和HLA-DR.与原粒细胞不能区分.II:CD11b快速上调,CD13CD33增加,CD45保持中等水平.HLA-DR减弱,仍为阳性.III:CD14快速上调,CD45也增加.CD13CD33HLA-DR阳性.成熟粒细胞与单核细胞HLA-DR表达不同,前者为阴性,后者为阳性:CD14在成熟单核细胞为阳性,而粒细胞为阴性.分选出:I原始B淋巴细胞II胞质IgM阳性IIIFMC7及表面IgM也在此期出现I:原始B细胞，表达CD34HLA-DRTdTCD10高表达，CD19CD45CD22较弱.II:CD19CD45量增加,CD10量减少.CD34TdT变阴性.CD20开始表达,CD22强度不变,仍较弱.III:CD20CD45到最