DNA的复制、修复与重组DNA技术

第十二章DNA的复制、修复与重组1转录翻译复制遗传信息的传递遗传信息的表达2

分子生物学中心法则(centraldogma)1958年Crick

1970年Temin和Baltimore

DNARNA蛋白质

转录翻译逆转录复制3第一节DNA复制的原则半保留复制(semiconservativereplication)半不连续复制(semi-discontimuousreplication)RNA引物复制起始点和复制方向4一、半保留复制定义：亲代DNA分子的两条链可以分别作为模板，按碱基互补配对原则，指导DNA新链的合成。新合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代DNA分子完全一样，但一条链来自亲代DNA链，另一条链是新合成的DNA链。5二、半不连续复制5`3`3`5`3`5`5`5`3`3`5`3`3`5`定义：DNA复制时，一条链是连续复制，另一条链是不连续复制，称半不连续复制。6前导链(leadingstrand)：在引物的3`端按5`

→3`方向连续不断地合成的DNA链。随从链(laggingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向不连续合成的DNA链。冈崎片段（Okazakifragment）：后随链上不连续合成的1000～2000或100～200个核苷酸组成的DNA小片段。7三、RNA引物定义：DNA复制时，子链5`端的一段寡聚核糖

核苷酸链，能为DNA聚合酶提供聚合新的脱氧核糖核苷酸所需的3`OH，最后可被切除。意义：提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的3`OH保证复制起始部位的真实性3`5`DNA模板3`5`DNA模板RNA引物5`OH-3`RNA引物5`OH-3`3`引物酶（RNA聚合酶）8第二节参与DNA复制的一些酶类和蛋白质一、原核生物大肠埃希菌的DNA聚合酶1、DNA聚合酶Ⅰ（Kornberg酶）发现:1955年Arshur.Kornberg（阿瑟.康恩伯格）1959年诺贝尔生理和医学奖活性:大片段5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性小片段5`→3`外切酶活性5`→3`外切5`→3`聚合3`→5`外切N`C`大片段Klenow片段小片段9罗杰.科恩伯格接受父亲（左）的祝贺

TheNobelPrizeinChemistry2006"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"RogerD.Kornberg罗杰.科恩伯格105`→3`外切酶活性功能：切除RNA引物切除突变片段，在DNA损伤修复中起作用5`→3`聚合酶活性

功能：填补片段切除后的空缺113`→5`外切酶活性TＧＣＡＣＡＴＡＡＣＧＴＧＴＡＣ5`3`5`3`T功能：校读功能（proofreading）意义：保证DNA复制的高度真实性

12DNA聚合酶Ⅰ多功能酶Klenow片段常用的工具酶5`3`3`5`132、DNA聚合酶Ⅱ活性：5`→3`聚合酶活性3`→5`外切酶活性功能：不确切

143、DNA聚合酶Ⅲ组成：多亚基复和物全酶

核心酶（αεθ）×2

连接二聚体（τ2）

单个运载夹钳复合物（γ2δδ`χψ）

β4

ααττεεθθδδ`γ2ψχββββ15功能：α亚基—5`→3`聚合ε亚基—3`→5`外切τ亚基—连接γ2δδ`χψ亚基复合物—钳夹β亚基—钳夹、滑动

特点：高续进性（≥50万个脱氧核糖核苷酸）

高效性（≈1000个脱氧核糖核苷酸/秒）

高保真实性（校读功能）16二、真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：α、β、γ、δ、ε五种功能：DNA聚合酶α—聚合随从链DNA聚合酶δ—聚合前导链（协同增殖细胞核抗原PCNA）DNA聚合酶γ—聚合线粒体DNADNA聚合酶β、ε—校读功能、参与DNA损伤修复17三、解链、解旋酶类和蛋白质（大肠杆菌E.coli）1、DNA解链酶

功能：解开DNA双链

条件：需要ATP供能，2个ATP/对碱基2、单链DNA结合蛋白

功能：维持模板单链状态

保护模板不受核酸酶水解18DNA拓扑异构酶Ⅰ功能：暂时切断双链中的一股，

另一股链旋转通过该缺口，

张力下降后，再连接缺口

DNA拓扑异构酶Ⅱ功能：暂时切断双链中的两股，

断端旋转，张力下降后，再连接缺口

条件：需要ATP供能3、DNA拓扑异构酶194、引发体组分：DnaA辨认并结合至复制起始部位DnaB解链酶作用DnaC帮助DnaB结合至复制起始部位引物酶RNA聚合酶，合成RNA引物205、连接酶功能：催化两段DNA链间形成3`5`磷酸二酯键特点：只能催化双链DNA链上的一股或两股链的连接5`5`3`3`5`5`3`3`3`5`5`5`5`5`3`3`3`3`21第三节DNA复制过程（大肠埃希菌）模板：单链DNA引物：RNA引物原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）聚合酶：DNA聚合酶辅助因子：Mg2＋其它：酶和蛋白因子方向：5`→3`22一、复制的起始1、复制起始部位oriC单一：原核生物通常只有一个复制起始点特定：高度保守序列GATCTNTTNTTTT

DnaA结合位点

真核生物有多个复制起始点GATCTNTTNTTTTTTATCCACADnaADnaADnaADnaA23DnaA:结合至oriC的4个DnaA结合位点，形成起始复合物作用于oriC的3个13bp序列，DNA在此处解链，形成开放型起始复合物DnaC:DnaB:解开复制起始部位的DNA双链帮助DnaB结合至复制起始部位24单链结合蛋白：稳定并保护已解开的DNA单链引物酶：RNA聚合酶，合成RNA引物维持模板单链状态252、复制方向双向复制复制眼（泡）：DNA复制时，局部解开DNA的双链，在电镜下呈眼泡状突起复制叉：DNA复制时，局部DNA双链解开，在复制前进部位两侧形成的Y型或叉状结构真核生物DNA复制原核生物DNA复制26二、复制的延长DNA拓扑异构酶解旋DNA聚合酶Ⅲ

催化3`5`磷酸二酯键形成，聚合DNA新链27复制叉前进“前导链和随从链同时同方向合成”问题的解决——随从链摸板环绕28二、复制的终止DNA聚合酶Ⅰ切除引物填补空缺5`3`3`3`3`5`5`5`DNA连接酶连接前后两个片段间的缺口295`3`3`3`3`5`5`5`四、真核生物端粒DNA的复制1、端粒：真核生物线性DNA的两个末端结构：由数百个串联排列的GT丰富的寡聚核苷酸序列组成人(AGGGTT)n四膜虫(GGGGTT)n功能：维持染色体DNA的稳定性302、端粒酶：防止端粒缩短的一种逆转录酶组成：由RNA和蛋白质组成蛋白质—DNA聚合酶RNA—模板唯一携带RNA模板的逆转录酶功能：复制端粒序列，防止端粒缩短。

31机制：3233端粒、端粒酶与肿瘤：生殖细胞、干细胞：端粒酶活性保持体细胞：端粒酶活性下降，正常衰老现象恶性肿瘤细胞：端粒酶的活性恢复，使细胞永生化，形成恶性增殖1994年，Couter人卵巢细胞端粒酶表达1997年，人端粒酶基因克隆85%肿瘤细胞中端粒酶活性升高34第四节DNA的损伤与修复一、DNA损伤的因素1、自发因素环境中溶剂分子随即热碰撞N-糖苷键断裂，A、G脱落磷酸戊糖碱基2、物理因素紫外线电离辐射共价交联，嘧啶二聚体单（双）链断裂，碱基脱落破坏，分子交联，脱氧核糖破坏3、化学因素亚硝酸盐CU35二、DNA损伤的类型1、点突变转换同型碱基颠换异型碱基调控序列影响基因表达编码序列有意突变—改变蛋白质功能

无意突变—个别氨基酸改变，蛋白质功能不变

静止突变—个别碱基改变，氨基酸不变镰刀型红细胞贫血N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu…….-C

N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Val.Glu…….-C

5`-***.***.***.***.***.CTC.***………-3`5`-***.***.***.***.***.CAC.***………-3`362、缺失一个核苷酸、一段核苷酸、一个基因Lesch-Nyhan`s综合症次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因丢失3、插入一个碱基、一段核苷酸芳香族分子等移码突变4、倒位37二、DNA损伤的修复机制1、光修复机制低等生物解聚嘧啶二聚体不需要光复活酶

需要光复活酶2、切除修复机制（暗修复）所有生物切割3`5`磷酸二酯键（扩创）、填补、连接UV特异的核酸内切酶着色性干皮病38

②AP特异的核酸内切酶③

DNA聚合酶I（5`→3`外切）PPPPOOOO5`3`④

DNA聚合酶I（5`→3`聚合）3、碱基切除修复机制①DNA糖苷酶⑤

DNA连接酶39

①切割错误碱基→②切割3`5`磷酸二酯键→③切除、填补→④连接DNA糖苷酶：特异识别一种DNA分子中改变的碱基，并水解该碱基与脱氧核糖间的糖苷键,形成AP位点。AP特异的核酸内切酶：切割3`5`磷酸二酯键DNA聚合酶I：切除损伤链，填补缺口连接酶：连接切口40为什么组成DNA是ATCG，而组成RNA是AUCG？尿嘧啶-DNA糖苷酶的发现尿嘧啶

胸腺嘧啶5`C甲基化5`C去甲基“区分正常的尿嘧啶与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶”的需要45511141复制的真实性1、半保留复制2、碱基互补配对原则3、RNA引物4、DNA聚合酶：校读功能5、端粒与端粒酶6、DNA的损伤修复机制7、尿嘧啶-DNA糖苷酶DNA（T）

RNA（U）42第五节重组DNA技术1、DNA重组：指两个DNA分子之间，或一个DNA分子的两个不同部位之间，通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的DNA分子间。

2、DNA重组技术：在实验室内，用人工方法将不同来源的DNA分子拼接成一个重组(recombinant)DNA分子，并将其引入活细胞内，使其大量复制或表达，这种技术称为DNA重组技术或基因工程。433、重组DNA技术的基本步骤（1）重组分子的构建（接）（2）引入宿主细胞（转）转化转染感染（3）筛选（筛）44（1）重组