上部现代仪器分析分离方法

色谱分析

本篇所介绍的内容是色谱分离和分析方法。它们包括气相色谱法、高效液相色谱法、高效逆流色谱、超临界流体色谱法和超临界流体萃取、毛细管电泳等。为了有效地进行定性定量分析，首先综合介绍色谱法的基本概念和基本理论等。1/13/20231§1概

述

色谱法(chromatography)与溶剂萃取、化学沉淀及电解沉积法等一样，也是一种分离技术。它和电泳技术一样，特别适宜分离多组分的试样，是各种分离技术中效率最高和应用最广的—种方法。最早创立色谱法的是俄国植物学家茨维特(Tsweet)，他在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的翠取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃柱内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。1/13/20232

在色谱法中，将填入玻璃柱内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相，自上而下运动的一相(一般是气体、液体或超临界流体)称为流动相，装有固定相的柱子(玻璃或不锈钢)称为色谱柱。

色谱法的种类很多，分类较复杂。

按照分离过程中，相系统的形式和特征，将色谱法分为柱色谱法、平板色谱法。

1/13/20233柱色谱法是将很细的固定相装入玻璃管内，流动相依靠自身的重力或外加压力通过固定相。随其固定相装填方法不同，又将柱色谱法分为填充柱色谱法和毛细管色谱法。前者是将固定相填充于一根玻璃或金属柱内，后者是将固定相附着在一根细而长的管壁内。柱色谱最大的优点是：柱效能高、分析速度快、定量较为可靠。1/13/20234在平板色谱法中，固定相可以是多孔的滤纸；也可将吸附剂或载体均匀地铺在一块玻璃板或塑料板上，让液体通过毛细现象或重力作用携带试样通过固定相。前者称为纸色谱法，后者称为薄层色谱法，平板色谱设备和操作简单，易于普及。1/13/20235依据色谱过程中流动相和固定相的物理状态分类是色谱法最根本的分类方法。

按流动相的物态分类：

气相色谱法--流动相为气体

液相色谱法--流动相为液体

超临界流体色谱法--流动相为超临界流体。按固定相的物态不同分类：

气相色谱法分为气固色谱法和气液色谱法

液相色谱法分为液固色谱法和液液色谱法1/13/202361/13/20237按色谱动力学过程，可将色谱法分为迎头色谱、顶替色潜和洗脱色谱。

迎头色谱：以试样混合物作流动相的色谱法；顶替色谱：用含吸附能力或其它作用能力较被分析组分强的组分作流动相的色谱法。

洗脱色谱：以吸附能力或其它作用能力比试样组分弱的气体或液体作流动相的色谱法。

1/13/20238洗脱色谱不仅能使试样各组分获得良好的分离，色谱峰清晰，同时除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质，是目前使用最广的一种方法。

线性洗脱色谱：两相间的浓度呈线性关系

非线性洗脱色谱：两相间的浓度不呈线性关系1/13/20239另外，按所利用的物理化学原理将色谱法分为

吸附色谱

分配色谱

离子交换色谱

凝胶渗透色谱

络合物色谱等。

1/13/202310§19—2

线性洗脱色谱及有关术语

在洗脱色谱法中，如果将试样注入色谱柱头，试样本身很快就会在固定相和流动相之间达到分配平衡。当流动相流过时，试样将在流动相和新的固定相上又达到分配平衡。同时，原来仍在固定相中的试样与新的流动相之间也会形成新的分配平衡。随着流动相不断的流过，它们就会携带发生分配平衡后而存在于流动相的试样沿着柱子向前移动。由于这个过程涉及到两相之间的分配平衡，所以可以用分配系数K来进行定量讨论。1/13/202311K=cs/cm

cs----组分在固定相中的浓度

cm---组分在流动相中的浓度。

溶质流过色谱柱时，分配系数大的组分通过色谱柱所需要的时间长，分配系数小的组分需要的时间短。

1/13/202312（1）当试样中各组分在两相的分配系数不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。（还可根据时间长短进行定性）

（2）让足够量的流动相通过色谱柱，就能在柱的末端收集到各组分。

（3）如果柱的末端有检测系统，并能以信号大小对时间作图，则可得到呈高斯分布的色谱流出曲线。1/13/202313与某一组分的色谱流出曲线有关的色谱术语。

一、基线

基线是柱中仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值，稳定的基线应该是一条水平直线。

1/13/2023141/13/202315二、峰高

色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图19—2中B’A。

三、保留值

(1)死时间tM，

不被固定相吸附或溶解的物质进人色谱柱时，从进样到色谱图上出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图19—2中O’A’。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流速将与流动相的流速相近。

1/13/202316(2)保留时间tR

试样从进样开始到柱后出现峰极大值时所经历的时间，称为保留时间，如图19—2中O’B.它相应于试样到达柱末端的检测器所需的时间。

(3)调整保留时间t’R

某组分的保留时间扣除死时间后称为该组分的调整保留时间，即

t’R=tR-tM1/13/202317由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所需的时间，所以t’R实际上是组分在固定相中停留的总时间。保留时间可用时间单位(如s)或距离单位(如cm)表示。

保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，在气相色谱中尤为如此，故色谱工作者常用保留体积等参数进行定性鉴定。

1/13/202318四、区域宽度

色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：

(1)标准偏差σ。

色谱峰是高斯曲线，可用标准偏差σ表示峰的区域宽度，即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图（19—2）中EF距离一半。

(2)半峰宽Y1/2

即峰高一半处对应的峰宽，如图（19—2）中GH间的距离：它与标准偏差的关系为

1/13/202319(3)基线宽度Y

即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图19—2中IJ的距离。

它与标准偏差σ的关系是：

Y=4σ

当标准偏差以时间为单位时，用τ表示，则有

Yτ=4τ

σ和τ关系可用下式表示：

1/13/202320

从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：

(1)根据色谱峰的个数，可以判断试样中所含组分的最少个数。

(2)根据色谱峰的保留值(或位置)，可以进行定性分析。

(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析：

(4)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。

(5)色谱峰两峰间的距离．是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。

1/13/202321§19—3

色谱法基本理论1/13/202322§19—3

色谱法基本理论

图19—3是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓，，图中KA>KB，因此A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时每一组分的浓度轮廓(即区域宽度)也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的：若要使A、B两组分完全分离，必须满足以下三点：

1/13/202323第一，两组分的分配系数必须有差异；

第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；

第三，在保证快速分离的前提下．提供足够长的色谱柱。

前两点是完成分离的必要条件：作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素.1/13/202324一、塔板理论

塔板模型将一根色谱柱视为一个精馏塔，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成.每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。塔板理论假设：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：

n=L/H(19-16)

n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。

1/13/202325

塔板理论指出：

第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般是很大的，如气相色谱柱的n约为103—106，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。

第二，当试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。

第三，n与半峰宽度及峰底宽的关系式为：

1/13/202326注意:式中tR与丫l/2(或Y)应采用同一单位(时间或距离).

在tR一定时，如果色谱峰越窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。

1/13/202327§19—4分

离

度

一、柱效和选择性

理论塔板数n是衡量柱效的指标，它反映了色谱分离过程动力学性质。

色谱图上两峰问的距离衡量色谱柱的选择性，其距离越大说明柱子的选择性越好。一般用选择因子α表示两组分在给定柱子上的选择性。柱子的选择性主要取决于组分在固定相上的热力学性质

1/13/202328二、分离度

图19—6是两相邻组分在不同色谱条件下的分离情况。从图中可以看出，(a)中两组分没有完全分离。(b)和(c)两组分完全分离，就(b)与(c)而言，前者的柱效虽不高，但选择性好；后者的选择性较差，但柱效高。由此可见，唯独用柱效或柱选择性并不能真实地反映组分在色谱柱中的分离情况，所以，在色谱分析中，需要引入分离度(Rs)这一概念。

1/13/202329分离度也称分辨率(resolution)：它是指相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值之比，即

1/13/202330一般来说，当Rs<1时，两峰总有部分重叠；当Rs=1时，两峰能明显分离；Rs=1.5时，两峰已完全分离。当然，更大的Rs值，分离效果会更好，但会延长分析时间。

利用(19

－

26)式，可以直接从色谱图上计算分离度。1/13/202331§19—5

定性和定量分析

一、定性分析

色谱定性分析的任务是确定色谱图上每一个峰所代表的物质。在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留时间。因此，在相同色谱条件下，通过比较已知物和未知物的保留值，即可确定未知物是何种物质。但是，一般来说，色谱法是分离复杂混合物的有效工具，如果将色谱与质谱或其它光谱法联用，则是目前解决复杂混合物中未知物定性分析的最有效的技术。

1/13/202332

二、定量分析

在一定的色谱条件下，组分i的质量(mi)或其在流动相中的浓度，与检测器响应信号(峰面积Ai或峰高hi)呈正比：和是绝对校正因子：(19—30)和(19—31)式是色谱定量分析的依据.1/13/202333(一)响应信号的测量

色谱峰的峰高是其峰顶与基线之间的距离，测量比较简单，特别是较窄的色谱峰。

测量峰面积的方法分为手工测量和自动测量两大类。现代色谱仪中一般都装有准确测量色谱峰面积的电学积分仪。如果没有积分装置，可用手工测量，再用有关公式计算峰面积。

峰面积的大小不易受操作条件如柱温、流动相的流速、进样速度等的影响，从这一点来看，峄面积更适于作为定量分析的参数。

1/13/202334(三)定量方法

色谱法一般采用外标法、内标法和归一化法进行定量分析。

外标法的优点是操作简单，因而适于工厂控制分析和自动分析；但结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性.

当只需测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，可采用内标法。具体做法是：准确称取试样，加入一定量某种纯物质作为内标物，然后进行色谱分析，再由被测物和内标物在色谱图上相应的峰面积(或峰高)和相对校正因子，求出某组分的含量。

1/13/202335根据内标法的校正原理，可写出下式：

式中ms、m分别为内标物质量和试样质量(注意：m不包括ms)，Ai、As分别为被测组分和内标物的峰面积；、把分别为被测组分和内标物的相对质量校正因子。1/13/202336在实际工作中，一般以内标物作为基准，即=1，此时(19—38)式可简化为

色谱法采用内标法定量时，因在试样中增加了一个内标物，常常给分离造成一定的困难。

1/13/202337归一化法是主要用于色谱法的一种定量方法。它是将试样中所有组分的含量之和按100％

计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下列公式计算各组分的质量分数：

1/13/202338当各组分的相近时，计算公式可简化为使用这种方法的条件是：经过色谱分离后，试样中所有的组分都要能产生可测量的色谱峰。

归一化法的主要优点是：简便、准确；操作条件(如进样量，流速等)变化时，对分析结果影响较小。这种方法常用于常量分析，尤其适合于进样量少而其体积不易准确测量的液体试样。1/13/202339气相色谱法

气相色谱法(gaschromatography，GC)。它是由惰性气体将气化后的试样带入加热的色谱柱．并携带分子渗透通过固定相，达到分离的目的。气相色谱分为气固色谱和气液色谱。

气固色谱:用多孔性固体为固

定相，通过物理吸附保留试样分子。分离的主要对象是在常温常压下为气体和低沸点的化合物。

气液色谱:多用高沸点的有机化合物涂渍在载体上作为固定相，利用分子在两相的分配系数不同分离试样。一般只要在450℃以下有1.56

kPa一10

kPa的蒸气压且热稳定性好的有机及无机物都可用气相色谱法来分离

1/13/202340气相色谱仪

一、气相色谱仪的工作过程

由高压钢瓶1供给的流动相载气，经减压阀2，净化器3，稳压阀4和转子流速计5后，以稳定的压力恒定的流速连续经过气化室6，色谱柱7，检测器8，最后通过皂膜流速计放空。气化室与进样口相接。它的作用是把从进样口注入的液体试样瞬间气化为蒸气，以便随载气带人色谱柱中进行分离。分离后的试样随载气依次进人检测器。检测器将组分的浓度(或质量)变化转变为电信号。电信号经放大后，由记录器记录下来，即得到色谱图。1/13/2023411/13/202342二、气相色谱仪

目前国内外气相色谱仪的型号和种类很多，但它们均由以下五大系统组成；气路系统、进样系统、分离系统、温控系统以及检测和记录系统。

(一)气路系统

气相色谱仪上有一个让载气连续运行、管路密闭的气路系统。它的气密性，载气流速和稳定性以及测量流量的准确性，对色谱结果均有很大的影响，因此必须注意控制。

1/13/202343

(1)载气

气相色谱中常用的载气有氢气、氮气、氦气和氩气。至于选用何种载气，主要取决于选用的检测器和其它一些具体因素。

(2)气路结构

气相色谱仪主要有两种气路形式：单柱单气路和双柱双气路，前者适用于恒温分析，—些较简单的气相色谱仪均属这种类型，如图10—1所示。后者适用于程序升温，并能补偿固定液的流失并使基线稳定。目前多数气相色谱仪属于这种类型。

1/13/202344(3)净化器

净化器是用来提高载气纯度的装置。净化剂主要有活性炭、硅胶和分子筛、105催化剂，它们分别用来除去烃类物质、水分、氧气。1/13/202345(4)稳压恒流装置

由于载气流速是影响色谱分离和定性分析的重要操作参数之一，因此

要求载气流速稳定。在恒温色谱中，操作条件一定时，整个系统阻力不变，因此用—个稳压阀，就可使柱子的进口压力稳定，从而保持流速恒定。但在程序升温色谱中，柱内阻力不断增加，载气的流速逐渐变小，因此必须在稳压阀后串接—·个稳流阀。

1/13/202346(二)进样系统

进样系统包括进样装置和气化室。其作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱前瞬间气化，快速定量地转入到色谱柱中。进样量的大小、进样时间的长短、试样的气化速度等都会影响色谱的分离效率和分析结果的准确性及重现性；

1/13/202347(1)进样器

目前液体试样的进样，一般都用微量注射器，常用的规格用1μL、5μL、10μL和50μL等。

(2)气化室

为了让试样在气化室中瞬间气化而不被分解，因此要求气化室热容量大，无催化效应。为了尽量减小柱前谱峰变宽，气化室的死体积应尽可能小。1/13/202348(三)分离系统

气相色谱仪的分离系统是色谱柱，它由柱管和装填在其中的固定相等所组成。由于混合物各组分的分离在这里完成，所以它是色谱仪中最重要的部件之一。

目前填充柱应用较为普遍。柱材可由金属或玻璃管制成。其内径一般为2—4

mm，长度1—10

m。柱形多为螺旋形，为了减小跑道效应，其螺旋直径与柱内径之比一般为15：1到25：1。

色谱柱的分离效果除与柱长、柱径和柱形有关外，还与所选用的固定相和柱填料的制备技术以及操作条件等许多因素有关。1/13/202349(四)温控系统

温控系统是用来设定、控制、测量色谱柱炉、气化室、检测室三处的温度。气相色谱的流动相为气体，试样仅在气态时才能被载气携带通过色谱柱。因此，从进样到检测完毕为止，都必须控温。同时，温度也是气相色谱分析的重要操作变量之一，它直接影响色谱柱的选择性，分离效率和检测器的灵敏度及稳定性。

在国产气相色谱仪中，多采用可控硅温度控制器连续控制柱炉的温度。对于沸点范围很宽的混合物，可采用程序升温法分析。

1/13/202350所谓程序升温，是指在一个分析周期内，炉温连续地随时间由低温向高温线性或非线性地变化，以使沸点不同的组分各在其最佳柱温下流出，从而改善分离效果，缩短分析时间。

气化室的温度应使试样瞬时气化而又不分解。在一般情况下，气化室的温度比柱温高10—50℃。

除氢火焰离子化检测器外，所有检测器对温度的变化都很敏感，尤其是热导池检测器，温度的微小变化将影响检测器的灵敏度和稳定性，因此，检测室的控温精度要求优于±0

1℃。

1/13/202351（五）检测器

1．检测器的分类

检测器是一种将载气中被分离组分的量转为易于测量的信号(—般为电信号)的装置。因微分型检测器给出的响应是峰形色谱图，它反映流过检测器的载气中所含试样量随时间变化的情况.且峰面积或峰高与组分浓度或质量流速呈正比.因此,常采用微分型检测器。1/13/202352微分型检测器:分为浓度型和质量型浓度型检测器(如热导池、电子捕获检测器)测量的是载气中组分浓度的瞬时变化，即响应信号正比于载气中组分的浓度。质量型检测器(如氢火焰离子化检测器)的响应值正比于单位时间内组分进入检测器的质量。1/13/2023532．检测器的性能指标

灵敏度

色谱检测器灵敏度的物理意义与测量仪器是一样的，即输入单位被测组分时所引起的输出信号：S=

△R/△m

S为灵敏度，△R为被测组分改变△m单位时相应的信号.

检测限

气相色谱仪检测器的定义为：恰能产生相当于3倍噪音(3

RN)的信号时，单位时间进入检测器的质量(对质量型检测器)或单位体积载气中所含的试样量的质量或体积(对浓度型检测器)：D=3RN/S

D为检测限，S为灵敏度。要降低仪器的检测限，必须在提高S的同时．最大限度地抑制噪音。

1/13/202354此外，对一个理想的色谱检测器还应具备如下特点：线性范围宽．噪音低，死体积小，响应快，并对各类物质均有响应。

1/13/2023553．几种典型的检测器

(1)热导池检测器

热导池检测器(thermal

conductivity

detector，TCD)是一种结构简单、性能稳定、线性范围宽、对无机和有机物质都有响应、灵敏度适宜的检测器，因此在气相色谱中得到广泛的应用。

热导池的测量是根据各种物质和载气的导热系数不同，采用热敏元件进行检测的。

.1/13/202356影响热导池灵敏度的因素

热导池检测器是一种检测柱流出物把热量从电热丝上传走的速率的装置，因此从热丝上带走热量的效率越快，其灵敏度就越高。影响灵敏度的主要因素有：桥路电流、载气、热敏元件的电阻值及电阻温度系数，池体温度等1/13/202357(2)氢火焰离子化检测器(Flame

ionization

detector，FID)：简称氢焰检测器。它具有结构简单、灵敏度