禽传染性支气管炎病毒S基因与猪IgGFc基因克隆与在Hela细胞中融合表达

禽传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgGFc基因的克隆及在Hela细胞中的交融表达第一页，共25页。背景综述目的及意义技术道路研究内容结果与分析致谢报告提纲第二页，共25页。背景综述病原体：IBV〔单股正链RNA病毒，有囊膜〕流行病学：呼吸道排毒;飞沫传播；埋伏期短；急性，高度接触性；自然感染仅发生于鸡,雏鸡发病最为严重；低温是发病的关键。临床病症：损害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等；呼吸型、肾型、腺胃型等；检测诊断：病毒别离、病毒中和、血凝抑制试验、RT－PCR；ELISA、AGP防治：预防为主〔环境＋疫苗〕，治疗为辅禽传染性支气管炎(IB)

第三页，共25页。结合受体，诱导中和抗体、血抑抗体、CTL反响S蛋白E蛋白M蛋白N蛋白infectiousbronchitisvirusIBV参与病毒装配〔与核衣壳互相作用，将其结合到囊膜〕具有大量抗原决定簇，能诱导产生中和抗体

参与病毒粒子的释放

IBV病毒粒子构造背景综述第四页，共25页。背景综述S蛋白：裂解为S1(90kD)和S2(84kD)的两个亚单位，均为糖蛋白。S1蛋白：由520～538个氨基酸组成。S1功能：别并结合宿主细胞膜上特异性糖蛋白受体参与膜交融氨基端参与决定毒株的组织亲和性及毒力抑制多数中和抗体IBVS1蛋白11737160N81269298C亲水区疏水区强亲水区S1蛋白(520-538AA)抗原决定簇第五页，共25页。背景综述IgG水解:2Fab+Fc大小相近,活性不同Fab：结合抗原Fc：结合活化补体哺乳动物IgGFc段能与SPA、SPG非特异性结合;将目的基因与IgGFc基因交融表达，利于鉴定和纯化！免疫球蛋白IgGFc段IgGFc第六页，共25页。目的及意义克隆猪IgGFc和IBVS1基因，为进一步开发以这两个基因为根底的疫苗和诊断方法做根底。表达S1-IgGFc，以IgGFc为蛋白标签，以期进一步利用亲合层析或免疫沉淀法，进展IBV细胞受体的别离与鉴定。第七页，共25页。技术道路扩取IBVS1基因扩猪IgGFc基因融合表达载体转染Hela细胞培养Hela细胞表达鉴定第八页，共25页。研究内容一.猪IgGFc基因的克隆和序列分析二.IBVS1基因的克隆和序列分析三.表达载体的构建四.重组表达载体在Hela细胞上的表达第九页，共25页。结果与分析第十页，共25页。猪IgGFc基因扩增一.猪IgGFc基因的克隆和序列分析扩增区域：铰链区——C末端不包括信号肽目的片段：1002bp上游：EcoRI位点下游：XhoI位点猪IgGFc基因的RT-PCR扩增第十一页，共25页。pMD18T－IgGFc构建图pMD18T-IgGFc/EcoRI+XhoI酶切鉴定:EcoRI+XhoI阳性：2680bp+1002bp猪IgGFc基因的克隆和序列分析第十二页，共25页。IgGFc序列分析测序结果：所获序列(略)1002bp，与预期一致，无终止子，334个氨基酸Blast比对：100％gi5052049,gi47523191,

gi43312794%gi33125蛋白预测：分子量大小约37kD在体内半衰期约100h，不含跨膜区不含信号肽，与预期相符猪IgGFc基因的克隆和序列分析第十三页，共25页。二.IBVS1基因的克隆和序列分析IBVS1基因的克隆S1基因PCR产物的电泳分析模板：含M41株S全长的质粒目的：19～536氨基酸上游BamHI，下游EcoRI去掉了信号肽保存裂解识别位点部分碱基，以增加空间间隔第十四页，共25页。pMD18T-S1构建pMD18T-S1鉴定鉴定:BamHI+EcoRI预期:2680bp＋1554bppMD18T-S1BamHI+EcoRI酶切禽IBVS1基因的克隆和序列分析第十五页，共25页。IBVS1序列分析测序：所获序列〔略〕大小1554bp，与预期一致，无中止子，含518个氨基酸Blast：99％〔M41株S1基因〕蛋白预测：稳定蛋白等电点8.17，分子量为58.9kD，在哺乳动物体内半衰期超过30h不含跨膜区没有信号肽禽IBVS1基因的克隆和序列分析第十六页，共25页。三.载体构建载体构建流程图顺序选择：S1位于上游S1功能区N端第十七页，共25页。pcDNA3.1-IgGFc的构建

双酶切:XhoI+EcoRI预期带:5.5kb＋1kbpcDNA3.1-IgGFc经XhoI＋EcoRI酶切表达载体的构建第十八页，共25页。的构建BamHI+XhoINdeI酶切鉴定:800bp＋1600bp＋5600bpIgGFcS1/BamHI+XhoIIgGFcS1/NdeⅠ表达载体的构建第十九页，共25页。四.重组载体在Hela细胞上的表达一抗：兔抗IBV阳性血清二抗：羊抗兔二抗荧光二抗结果：试验组观察到特异性绿色荧光，对照组无绿荧光说明：IBVS1基因在Hela细胞中获得了表达，且有活性

间接免疫荧光检测IBVS1基因在Hela细胞上的表达IFA检测IBVS1基因的表达第二十页，共25页。直接检测IgGFc的表达方法：直接免疫荧光二抗：羊抗猪二抗结果：试验组有较明显的绿荧光，而对照组无。说明：IgGFc基因在Hela细胞内获得表达，且有活性直接免疫荧光检测IgGFc基因在Hela细胞上的表达重组载体在Hela细胞上的表达第二十一页，共25页。斑点杂交检测

方法：Dot-blot〔直接和间接〕裂解液：都能检测到强烈的阳性反响上清：检测不到阳性反响说明：细胞内表达,产物兼具IBVS1和IgGFc活性斑点杂交检测IgGFcS1基因在Hela细胞上的交融表达A,B:为直接检测结果C,D:间接检测结果重组载体在Hela细胞上的表达第二十二页，共25页。小结通过RT-PCR从猪肝脏总RNA中扩增到IgGFc基因，并进展测序和序列分析。PCR扩增得到禽传染性支气管炎病毒S1基因进展测序和序列分析。构建了IBVS1基因和猪IgGFc基因交融表达的真核表达载体，并在Hela细胞上实现了其交融表达。经检测，表达产物主要存在于细胞内，且同时具有IBVS1活性和IgGFc活性。第二十三页，共25页。致谢本论文