细胞因子与病理过程

细胞因子与病理过程

中国医科大学病理学教研室王恩华第一页，共91页。细胞因子cytokinesconcept：是由细胞产生和分泌的低分子量的多肽类介质effect：参与调节细胞生长、分化、器官发育;炎症、免疫、肿瘤、损伤、修复等许多病理及生理过程来源：血管内皮细胞、WBC〔中性、单核巨噬细胞、LC〕、纤维母细胞、神经组织、平滑肌细胞、软骨组织、肿瘤细胞等第二页，共91页。1.白细胞介素类interleukinsILs2.集落刺激因子类colonystimulatingfactorsCSFs3.肿瘤坏死因子类tumornecrosisfactorsTNFs4.淋巴因子类lymphokines5.化学趋化因子类chemotacticfactors6.生长因子类growthfactors7.细胞粘附因子类celladhensionmolecules总之：几乎所有组成多细胞间复杂的生物信号语言中的各个元件，均属此范畴Classification第三页，共91页。细胞因子：autocrine(自泌)paracrine(旁泌)

在部分起作用激素：endocrine(内分泌)、经血到远隔器官起作用一样点：细胞产生、分泌，作用受体，放大作用细胞因子与激素的运行机制不同第四页，共91页。举例部分损伤、细胞产生因子、只对部分细胞产生影响，如象激素一样入血，对全体细胞都产生影响，就费事了。细胞因子种类很多，作用广泛，与细胞外基质也有着亲密的联络，下面仅就常见的细胞因子作以简介第五页，共91页。Wnt通路中的关键分子

与肺癌侵袭转移王恩华中国医科大学第六页，共91页。研究背景1在中国肺癌的发生率在过去的30年里上升了465%，死亡率居恶性肿瘤之首每年死于肺癌的患者约45万人，其中约有40万人死于肺癌的转移因此提醒肺癌侵袭转移的分子机制和寻找治疗关键靶点，具有重要意义第七页，共91页。研究背景2Wnt通路中的关键分子GSK-3B、APC和B-catenin与肿瘤侵袭转移的关系已有较多报道，而位于其上游的DVL和Axin是如何调控肿瘤侵袭转移的那么少有报道与B-catenin同一家族的p120ctn是否与Wnt通路有关尚不清楚已有报道p120ctn能与Kaiso结合，而Kaiso只有入核信号，没有出核信号，那么p120ctn是否具有调节Kaiso核浆分布的作用，进而影响肿瘤的侵袭转移尚无报道第八页，共91页。

β-catenin在正常支气管上皮细胞表现为膜表达，而在NSCLC中主要表现为细胞浆或核内的蓄积，这种蓄积与NSCLC的低分化和淋巴结转移相关

1.Axin对NSCLC中β-catenin蓄积所起的作用第九页，共91页。

我们用SSCP和直接测序法检测了

100例NSCLC中β-catenin第三外显子突变情况，结果发现β-catenin的第三外显子无一例突变

AmJClinPathol.2006,125(4):534-541第十页，共91页。是什么原因造成了β-catenin在肺癌细胞中的蓄积？

我们发现Axin在NSCLC中的表达明显下调Axin的表达下调与NSCLC的不良预后明显相关第十一页，共91页。转染Axin可明显抑制肺癌细胞的侵袭转移和增殖才能

过表达Axin可使肺癌细胞中高表达的β-catenin出现明显下调我们猜测：Axin的表达减少可能是导致β-catenin在NSCLC中蓄积的原因之一AnnSurgOncol2007,14:3251-9第十二页，共91页。我们将新颖的NSCLC组织经1grayX-ray照射后发现Axin的蛋白和mRNA均出现了明显的上调，同时Caspase-3的表达也出现了明显的上调

既然Axin有如此明显的抑癌作用，如何上调Axin的表达呢？第十三页，共91页。因此，X-ray是否能上调Axin的表达及程度是断定NSCLC是否对X-ray治疗敏感的有用指标X-ray照射或转染Axin都能上调肺癌细胞的凋亡率，转染Axin加上X-ray照射可使凋亡率明显增加第十四页，共91页。Axin诱导细胞凋亡的机制是什么？

转染Axin或不与p53结合的△-Axin，再用p53抑制剂PFT-α或JNK抑制剂SP处理

结果发现Axin通过p53和/或JNK通路促进肺癌细胞凋亡IntJRadioOncol第十五页，共91页。我们意外地发现：过表达Axin可以下调TCF-4的转录，但机制不清

已有文献报道：β-catenin具有促进TCF-4转录，而p53具有抑制TCF-4转录的才能而Axin既具有下调β-catenin的才能，又有激活p53的才能因此，Axin既有可能是通过β-catenin，也有可能是通过p53下调TCF-4的转录第十六页，共91页。我们为了讨论这个问题，构建了Axin不能与β-catenin结合，Axin不能与p53结合，以及Axin既不能与β-catenin也不能与p53结合的突变体第十七页，共91页。转染Axin在下调β-catenin表达的同时可明显下调TCF-4的表达，但转染Axin△β-ca即保存了p53作用时却不能下调β-catenin和TCF-4，但由于BE1细胞系是p53突变型细胞系，因此尚不能确定Axin是否具有通过p53下调TCF-4的作用

因此，我们向BE1细胞中转染了野生型p53，结果显示单纯转染野生型p53可以下调TCF-4，但共转染Axin△β-ca和p53后TCF-4并没有出现进一步下调，说明Axin并不能加强p53下调TCF-4的作用

MolCancer.Feb2;9:25.第十八页，共91页。二、DVLs对Wnt通路的调节作用非小细胞肺癌组织中存在DVL-1和3的过表达，其表达与高TNM分期、低分化有关

第十九页，共91页。Dvls在淋巴结转移灶中的表达总是高于原发灶Dvl-1和Dvl-3的过表达与非小细胞肺癌的不良预后相关LungCancer()62,181—192第二十页，共91页。我们发现：过表达Dvl-1可以明显的上调β-catenin的蛋白程度，同时激活TCF-4依赖的转录活性，说明Dvl-1主要参与经典的Wnt通路

而过表达Dvl-3却不能明显上调β-catenin程度和TCF-4依赖的转录活性

但无论过表达Dvl-1还是Dvl-3均能明显增强肺癌细胞的侵袭转移才能第二十一页，共91页。我们发现：转染Dvl-3能明显上调肺癌细胞中磷酸化的JNK和p38程度

那么Dvl-3是怎样促进肺癌细胞侵袭转移的呢？Molecularcarcinogenesis()第二十二页，共91页。并且明显下调RhoA的活性上调Cdc42和Rac1活性

由于小GTP酶活性和JNK、p38均与非经典的Wnt通路有关，因此我们可以得出如下结论：Dvl-1主要通过经典Wnt通路而Dvl-3主要通过非经典Wnt通路促进肺癌细胞的侵袭和转移第二十三页，共91页。我们发现：过表达DVL-3上调p120mRNA程度但是转染Dvl-1却不能第二十四页，共91页。转染Dvl-3可以增加Pax6的表达无论是应用Pax6的单克隆抗体阻断，还是用siRNA敲出Pax6，都可以明显的下调p120ctn的转录

第二十五页，共91页。ChIP分析证实了转录因子Pax6可以直接与p120ctn的启动子区结合

上述结果说明：Dvl-3调节Pax6，而Pax6又与p120ct的启动子区作用，进而启动了p120ctn的转录

但Dvl-3是如何上调Pax6的尚不清楚第二十六页，共91页。上述结果提示我们p120ctn通过Dvl-3与Wnt通路联络p120ctn与Wnt通路之间还存在哪些联络呢？3.p120ctn在肺癌侵袭和转移中的作用，及其与Wnt通路的联络第二十七页，共91页。p120ctn在肺癌中的异常表达及意义P120ctn的异常表达与低分化，高TNM分期，淋巴结转移及不良预后相关HistolHistopathol2006,21:841-847APMIS2007,115:848–56

第二十八页，共91页。肺癌中p120ctn-1A、3A和E-cadherin的表达下调与smallGTP酶过表达相关LungCancer63()375–382第二十九页，共91页。敲除p120ctn后，Pulldown结果证实cdc42、Rac1活性增强，但RhoA活性下降E-cadherin的蛋白表达下降第三十页，共91页。敲除p120ctn后S期细胞比例增加、侵袭和转移才能增强CancerSci,100:441–448第三十一页，共91页。

过表达p120-1A下调Rac1活性而过表达p120-3A下调Cdc42活性第三十二页，共91页。p120ctn-1A和3A都可抑制肺癌细胞增殖、侵袭和转移

但是p120ctn-1A抑制肺癌细胞侵袭转移的才能强于3A

而p120ctn-3A抑制增殖的才能明显强于1A

ExpCellRes,315:890-898第三十三页，共91页。我们发现：转染p120-1A可以明显的上调β-catenin的蛋白和mRNA的表达我们得出以下结论:p120ctn-1A通过β-catenin与Wnt通路关联

用siRNA敲出p120ctn后β-catenin的蛋白和mRNA程度出现明显下调第三十四页，共91页。Kaiso是如何出核的？4.Kaiso在肺癌侵袭转移中的作用第三十五页，共91页。Kaiso过表达与NSCLC不良预后相关BMCCancer.,9:178第三十六页，共91页。无论是在肺癌原发灶和淋巴结转移灶中，Kaiso和p120ctn总是呈现同样的表达部位免疫共沉淀证实，无论在肺癌组织还是细胞系中，Kaiso和p120都可以形成复合体第三十七页，共91页。干扰p120后Kaiso核内增多，核浆蛋白别离进一步验证Kaiso在核内分布增多说明：p120无论在细胞浆还是在核内，都能与Kaiso结合第三十八页，共91页。转染p120ctn-3A，Kaiso和p120ctn主要为浆表达LMB阻断p120ctn出核那么p120ctn和Kaiso主要位于核内转染p120-NLS-3A入核序列质粒那么p120ctn位于核内，Kaiso也位于核内我们得出结论：p120ctn-3A影响Kaiso的核浆分布，Kaiso的出核依赖与p120ctn-3A的存在ExpCellRes(revised)第三十九页，共91页。结论：Axin、DVL、p120ctn、Kaiso在肺癌侵袭转移中发挥着重要的调控作用β-catenin在NSCLC中蓄积是由于Axin表达下调所致，过表达Axin或用X线照射肺癌组织上调Axin的表达，都可明显抑制肺癌的侵袭转移，促进肺癌细胞凋亡P120与Wnt通路中的关键分子Dvl-3和β-catenin相关Kaiso是通过与p120-3A结合被携带出核的第四十页，共91页。Publishedariticles(directlyrelative)

1.AxindownregulatesTCF-4transcriptionviabeta-catenin,butnotp53,andinhibitstheproliferationandinvasionoflungcancercells.MolCancer.Feb2;9:25.2.CytoplasmicKaisoisassociatedwithpoorprognosisinnon-smallcelllungcancer.BMCCancer.Jun9;9:178.3.Kaisoisexpressedinlungcancer:itsexpressionandlocalizationisaffectedbyp120ctn.LungCancer,67(2):205-215.4.X-rayinducesnon-smalcelllungcancerapoptosisbyupregulatingAxinexpression.InterJRadOnc.Biol.Phys.,75(2):518-265.Ablationofp120-CateninEnhancesInvasionandMetastasisofHumanLungCancerCells.CancerSci.,100(3):441-448.6.Abnormalexpressionofp120-catenin,E-cadherin,andsmallGTPasesissignificantlyassociatedwithmalignantphenotypeofhumanlungcancer.Lungcancer.,63:375-382.7.P120-cateninIsoforms1Aand3ADifferentlyAffectInvasionandProliferationofLungCancerCells.Expcellres.,315(5):890-898.第四十一页，共91页。8.Dishevelledfamilyproteinsareexpressedinnon-smallcelllungcancerandfunctiondifferentiallyontumorprogression.LungCancer.;62(2):181-199.Reductionofp120(ctn)isoforms1and3issignificantlyassociatedwithmetastaticprogressionofhumanlungcancer.APMIS.2007,115(7):848-56.10.OverexpressionofAxinDownregulatesTCF-4andInhibitstheDevelopmentofLungCancer.AnnSurgOncol.2007,14(11):3251-9.11.Abnormalbeta-cateninandreducedaxinexpressionareassociatedwithpoordifferentiationandprogressioninnon-smallcelllungcancer.AmJClinPathol.2006,125(4):534-541.12.Abnormalexpressionandclinicopathologicsignificanceofp120-catenininlungcancer.HistolHistopathol.2006,21(8):841-847.13.ExpressionofTcellfactor-4innon-smallcelllungcancer.ChinMedJ.2005,118(2):136-40.14.Connexin43recruitsE-cadherinexpressionandinhibitsthemalignantbehaviouroflungcancercells.FoliaHistochemCytobiol.;46(3):315-21.15.Expressionofserinethreoninekinase15isassociatedwithpoordifferentiationinlungsquamouscellcarcinomaandadenocarcinoma.PatholInt.2006,56(7):375-380.

第四十二页，共91页。是由细胞产生或分泌，对细胞生长，分化等具有显著调节作用的多肽目前已发现的生长因子已有50多种，并有新的因子的报道，其中部分生长因子的构造与生物学活性已根本搞清，有的已商品化，并在临床上得以应用一、生长因子growthfactor第四十三页，共91页。意义对各类生长因子的广泛深化的研究，将有助于人类对胚胎发育、组织与器官的形成等根本生物学问题的认识〔如干细胞〕同时对肿瘤，血管疾病的诊断治疗以及对创伤修复技术的进步等都将产生宏大的影响第四十四页，共91页。〔一〕生长因子分类生长因子种类繁多，来源复杂，构造各异，生物学作用与其它细胞因子间又有穿插，因此，单靠一种分类方法是缺乏以反响生长因子的本质和作用机制的。目前的分类方法有以下几种第四十五页，共91页。①细胞生长促进因子②细胞生长抑制因子——生长抑素注意同一种生长因子，对不同的组织细胞或同一种组织细胞的不同生长阶段，可有相反的作用如转化生长因子〔TGF-β〕早期纤维母细胞生长↑，晚期起抑制作用，对细胞的增殖既有促进又有抑制第四十六页，共91页。①单链多肽——表皮生长因子EGF②含糖链的多肽二聚体蛋白——PDGF③糖蛋白——集落刺激因子CSF和白细胞介素IL第四十七页，共91页。①单价因子——一种因子只作用于一类细胞②多价因子——一种因子可作用于不同类型细胞第四十八页，共91页。①增殖因子——IL-2、IL-3、GM-CSF、BCGF②分化因子——IL-2、IL-3、BCGF、IFN③效应因子——TNF第四十九页，共91页。〔二〕生长因子作用的靶细胞范围

随着对各类生长因子的认识不断加深，发现生长因子的作用和作用范围都较原来发现时广得多，宽得多举例在免疫细胞中别离出来IL-I，起初认为是调节免疫系统的信号分子，后来发现，还对角质细胞、f母细胞，星状细胞，软骨细胞有作用第五十页，共91页。另外从非免疫细胞中别离出来的转化生长因子TGF-β却有着很强的免疫调节作用，在抑制T细胞功能上要比环孢霉素至少强10倍。同时也有很强的抑制B细胞合成免疫球蛋白的作用。因此，它是在器官移植方面，一个非常好的生物制剂第五十一页，共91页。〔三〕生长因子作用的处境依赖性生长因子的作用及作用强度是视其周围环境条件而定的，即依赖于受体和其它效应分子的存在举例TGF-β在EGF存在时，对f母细胞的生长起抑制作用TGF-β在PDGF存在时，对f母细胞的生长起促进作用另外TNF在IL-1和TGF-β存在时才发挥作用因此要辩证地对待生长因子作用的广泛性、可变性第五十二页，共91页。〔四〕生长因子与原癌基因产物的关系绝大多数原癌基因产物已被证明都是与细胞生长，增殖、分化有关的蛋白质。现已搞清，生长调控基因与原癌基因，在很大程序上就是一回事举例sis基因表达产物与PDGF的B链有92%的同源性，erbB基因产物与EGF受体高度同源所以，在一定程度上讲，癌蛋白就是生长因子、受体、细胞内信号转导因子或DNA结合蛋白第五十三页，共91页。〔五〕生长因子的临床应用生长因子参与了炎症、血管新生、损伤修复和肿瘤的发生开展。在肿瘤形成中起关键作用的生长因子，在炎症、损伤修复中，却是一种正常的反响性的生理表达，这种表达也是至关重要的第五十四页，共91页。目前应用①TGF-β用于抑制免疫反响和排斥反响

②bFGF用于抑制肿瘤内血管形成

③GM-CSF用于再障或放化疗后几乎每种生长因子都可用基因重组方法消费，将来的10年将是生长因子从根底到临床过渡的10年第五十五页，共91页。几种常见的生长因子：platelet-derivedgrowthfactorPDGF，最初是在血小板中发现的一种促分裂剂1)这一名称不够准确，因为血小板可产生许多生长因子①血管内皮细胞生长因子vascularendothelialgrowthfactor，VEGF②表皮生长因子epidermalgrowthfactor，EGF③转化生长因子transforminggrowthfactor-β，TGF-β第五十六页，共91页。2〕另外，许多细胞都可产生PDGF如VSMC、表皮细胞、皮肤f母细胞、肿瘤细胞PDGF分子量为28-35KDa，由A、B两条链组成，B链与sis原癌基因编码蛋白有92%同源性体内存在形式：PDGF-AAPDGF-BBPDGF-ABA链与A受体结合B链即能与B又能与A结合购置抗体时应注意实验的组织或细胞上是否存在被检受体第五十七页，共91页。生物作用①诱导细胞增殖，是一种强促有丝分裂剂②趋化作用，引起间充质细胞、单核细胞、中性粒细胞，定向迁移及释放颗粒③引起Ⅲ-Ⅴ型胶原的合成和分泌，调节细胞外基质第五十八页，共91页。PDGF的临床意义1)创伤修复创口处血小板沉积→PDGF→中性WBC、单核/巨噬C内移去除异物→capf母细胞、SMC→内移、增生→肉芽→填补伤口capf母细胞、SMC释放PDGF→C.T增生、增加胶原沉积→愈合第五十九页，共91页。举例Knighton采用病人自身血小板释放物质〔PDGF〕，处理因糖尿病出现的难愈合的皮下溃疡，使濒于截肢危险的溃疡得到了愈合第六十页，共91页。2)动脉粥样硬化形成及血管再狭窄动脉内皮细胞血小板增殖→内膜增厚→SMC收缩型→分泌型→胶原沉积→硬化PTCA血管移植→PDGF→VSMC游走→分裂→PDGF→SMC游走、增殖→再狭窄restenosis第六十一页，共91页。设想①用单克隆抗体中和部分产生的PDGF在动物及细胞培养上获得成功，但用于人体，给药途径受到限制②antisenseRNA部分转染，可以研究讨论③抑制疤痕形成→中和抗体和反义RNA技术等第六十二页，共91页。但应注意PDGF的作用，不是孤立的，它是在其它细胞因子和生长因子也参与细胞反响的复杂环境中发挥其作用的，也就是说，抑制了PDGF的作用只是一个方面，而其它的因子仍然在起作用，在断定实验结果时，要综合进展考虑第六十三页，共91页。fibroblastgrowthfactor最初是在脑和垂体中发现，对纤维母细胞有促分裂作用而命名的。FGF本身种类繁多，由于制备方法和来源不同给予许多特殊命名，因此，极易混淆。如肝素结合生长因子等。多数人认为，按其等电点分为两类比较适宜，即aFGF和bFGF第六十四页，共91页。FGF与原癌基因hst，int-2编码的蛋白有很大同源性来源f母c，血管内皮C、SMC，粒C，肾上腺皮质C、星形胶质C，肿瘤细胞等第六十五页，共91页。生物作用①强的血管生长因子，诱发新生cap作用②促进创伤愈合和组织修复③参与胚胎发育和分化④刺激外周神经再生和营养神经的作用⑤调节内分泌的作用第六十六页，共91页。FGF的临床意义①创伤愈合FGF用于治疗胃溃疡方面的尝试最多，但由于FGF不稳定，全身投与很难到达胃溃疡部位，直接口服由于胃酸的破坏使其作用大大减弱方法：FGF可与肝素结合，不仅稳定，且耐酸、耐热，可获较好的效果第六十七页，共91页。②肿瘤治疗实体肿瘤无一例外均能产生FGFautocrineautointra-factorparacrine→血管生长自身增殖第六十八页，共91页。举例①利用bFGF单抗中和FGF，到达对肿瘤的治疗，在动物体内获成功②苏拉明阻止bFGF与受体结合，到达了对肿瘤的抑制第六十九页，共91页。设想①用人的bFGF单抗和受体单抗，结合介入部分给药，或放入支架制成缓释剂②结合介入，部分给予反义RNA-基因治③内皮支架基因表达第七十页，共91页。③促进侧枝循环的形成大面积心梗最令人担忧的是猝死，但经抢救免于一死，也担忧心脏破裂或室壁瘤的出现。如何加强梗死部位的强度，最好的方式就是能尽快机化。而bFGF是一种强的新生Cap生成因子。国外在狗模型中证实给梗死部位血管内注入bFGF，很快使梗死面积缩小，组织学上有较多的侧枝循环的出现。说明FGF用于治疗心梗方面可望成为可能第七十一页，共91页。④血管再狭窄PTCA→bFGFPDGF→SMS增生→restenosis设想：狗+介入球囊→心梗模型、冠状血管狭窄

模型放置→注入bFGF——心梗缩小→注入bFGF抗体→狭窄减轻反义RNA⑤周围神经再生脊髓损伤+bFGF促进神经纤维膜细胞生长，轴突长入第七十二页，共91页。epidermalgrowthfactorEGF是一个较早被发现的生长因子，EGF基因与V-mos原癌基因有部分同源性，EGF受体基因与erbB-1基因有75%以上同源性，在人体主要存在于各种体液或分泌物中，促进愈合，其中前列腺液、乳液中最高。除表皮细胞外，对许多细胞都有促进生长作用第七十三页，共91页。应用①细胞培养——培养液中参加EGF②角膜损伤修复：在动物角膜上早获成功，将EGF制成点眼液，使角膜烧伤无法愈合，只留光感的患者，几周后恢复正常第七十四页，共91页。③皮肤创伤愈合1)植皮病人，加用EGF明显到达了促进创面愈合的目的2)EGF体外培养自体表皮或表皮细胞，繁殖到一定数量后，将培养好的表皮植入创面，或将培养的表皮细胞象播种一样撒在创面，不仅加快愈合，也减少了疤痕产生第七十五页，共91页。二、白细胞介素interleukins为淋巴因子家族中一类，是联络白细胞间互相作用的细胞因子。共有18种，IL1-13研究的比较多，IL14-18是最近才被命名的主要生物学作用：1.参与免疫反响在移植物排斥反响、哮喘疾病发生、肿瘤免疫中均起重要作用它们的作用互相协同而加强如IL-1BC增殖、分化、产生抗体TC产生IL-2及IL-2受体IL-4,5可协同加强IL-1对BC的作用第七十六页，共91页。IL-1使机体发热，外周WBC升高，促进内皮细胞表达粘附分子，增进WBC与之粘附IL-8是中性WBC趋化因子和激活因子IL-12是T、NK细胞等免疫效应细胞的促进因子，具有抗寄生虫、病毒和细菌和抗肿瘤等功能第七十七页，共91页。

IL-1与酸性FGF有同源性，促进血管新生IL-2可使f母C数量增加第七十八页，共91页。

IL-12使NK细胞激活使CD8+T细胞→细胞毒淋巴细胞CTL这已在IL-12转基因动物研究中得到证实IL-2使T细胞→淋巴细胞激活的杀伤细胞LAK细胞从外周血别离TC、经IL-12、2作用后，回输给病人→抗肿瘤作用第七十九页，共91页。白细胞介素功能很多，作用极强，互相间有重叠，诱导穿插，协同和拮抗，需要进一步研究的方面较多，但抗病毒、抗肿瘤和免疫调控作用是肯定的。目前，绝大多数IL可用基因工程方法消费，相信不久将广泛用于临床为人类造福第八十页，共91页。三、细胞粘附分子celladhensionmoleculesCAMSConcept:是一群在多种细胞上表达，介导细胞间