蛋白质和氨基酸测定1(2学时+)资料word版本

蛋白质和氨基酸测定1(2学时+)资料椰子汁中蛋白加热沉淀黄酒贮藏中的沉淀大部分为蛋白质2、影响食品色、香、味及结构面筋蛋白：面包粉≥33%；蛋糕粉:≤22%馒头粉25%-30%（

SB/T-93

）2第一节蛋白质的定量测定定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。一、凯氏定氮法奶粉中测得氮含量为2.12%,蛋白质含氮为16%，奶粉中蛋白质含量?

换算系数通常6.25，牛乳及制品为6.38，大豆及制品为5.71等。3CHON脱水性：将H、O按2：1比例脱去，剩下C、N氧化性：2H2SO4+C＝2SO2↑+2H2O+CO2↑3SO2+2N+3H2O=3SO3↑+2NH3↑H2SO4

酸性：H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4

丹麦化学家JohanKjeldahl（1883）发明的，当时只用H2SO4分解试样，需长时间，后来Gunning改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升从而加快分解速度。后来……41、原理样品与硫酸、催化剂加热消化，蛋白质分解，其中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解；硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的指示剂（CuSO4蓝绿色如果没消化完全，则为Cu2SO4）、蒸馏前加入碱量合适否的指示剂。2CuSO4+C=Cu2SO4+SO2+CO2

Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+SO2+2H2O52、过程——消化、蒸馏、吸收、滴定（1）消化小火至泡沫消失→加大火力至透明无黑粒，摇动使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30min→绿色6（2）蒸馏与吸收常量凯氏定氮微量凯氏定氮改良微量凯氏定氮7A、蒸馏完全判断

经验时间：常量凯氏定氮约30min，微量定氮装置中是指示剂变色后，再蒸馏10min，提离液面，再蒸馏1min；萘氏试剂遇氨气呈红棕色。

配制：3.5gKI+1.3gHgCl2

溶于70ml水，加4mol/lNaOH30ml。B、吸收用2%或4%硼酸作为吸收液，应注意接收管浸没在吸收液中。C、常量、半微量、微量概念8常量：＞0.1g，＞10mL；半微量：0.01g-0.1g，1mL-10mL；微量：0.1mg-10mg，0.01mL-1mL。

eg:称样0.85g,消化后，直接蒸馏，取出消化液，定容至100mL，取其中的10mL蒸馏……常量凯氏定氮改良微量凯氏定氮9（3）滴定

(NH4)2B4O7+HCl+H20→NH4Cl+H3BO3

用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。指示剂：0.1%甲基红+0.1%溴甲酚绿终点判定

2%硼酸溶液，蓝绿色→灰色

4%硼酸溶液，蓝绿色→酒红色主要与混合指示剂的变色范围有关：

pH＜4.0红色

=5.1灰色＞6.2绿色10样品中被恶意添加硫酸铵、氯化铵，？样品中被恶意添加硝酸铵，？样品中被恶意添加碳酸铵，？样品中被恶意添加尿素、三聚氰胺，？N含量66.67%11策略一：甲醛法测定样品消化前铵盐含量

4NH4++6HCHO=(CH2）6N4H++3H++6H2O

OH-

六次甲基四胺（弱碱，pH8.7）

(NH4+是极弱的酸，不能直接用NaOH滴定）过程：样品+适量蒸馏水→NaOH中和游离酸（甲基红指示剂，红色变橙色，pH为4.4－6.2

）→加入甲醛→充分摇匀,静置5min→用NaOH标准溶液进行滴定（酚酞指示剂，pH为8.0－9.6

）12注意：A、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲醛中有甲酸，宜用NaOH先中和，此时指示剂用酚酞。B、但要注意，甲醛也能和氨基酸发生反应，且能使酸性相对凸显。C、碳酸铵不能用这种方法测定，因为生产的碳酸为弱酸，不能用NaOH滴定，况且CO2会挥发。D、硝酸铵中NO3-中的N不能被直接测出，但可以通过分子式中的定量关系求出。13策略二：牛奶中铵盐的定性检测2NH4++2I-+2ClO-=NHI2↓+NH3+2Cl-+2H2O过程：奶样5ml，加入KI约0.25g，缓慢逐滴加入含NaClO5%的NaOH混合试剂，并同时观察奶样与最后所加试剂两者界面处的颜色变化，若出现棕灰至黑色浑浊，表明样品掺有铵盐。（于琴，董文宾，赵旭博，郑丹.鲜奶中铵盐快速检测新方法研究.中国乳品工业.2004，32，8.）14策略三：非蛋白质有机物物中的N，改用别的方法来测定蛋白质或别的方法测定恶意添加物。

三聚氰胺检测（GB/T22388-2008）HPLC（高效液相色谱法）、HPLC-MC、GC-MSHPLCA、提取超声波及振荡下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心除杂。B、净化

阳离子固相萃取柱，用水、甲醇洗脱除杂，氨化乙醇洗脱，收集洗脱液，备用。15C、测定

C8或C18柱流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成流速1mL/min，柱温40℃，进样量20μL

波长240nm。16二、分光光度法方法原理紫外吸收法蛋白质在280nm处有吸收。

考马斯亮蓝比色法考马斯亮蓝使蛋白质染色，在620nm处有最大吸收（标准物质：牛血清蛋白bovineserumalbumin）。双缩脲法双缩脲与碱性铜生成紫红色配合物，在560nm处有最大吸收。（备注1）lowry法蛋白质-铜络合物中的酪氨酸及色氨酸残基使磷钼酸-磷钨酸（Folinphenolreagent）还原成蓝色物质。（备注2）17备注1：双缩脲法18备注2：（1）lowry法的原理色泽的变化主要缘于钼、钨化学价的降低，该物质的吸收波长在550-750nm之间，当蛋白质浓度在1-100μg/ml时，用750nm或660nm，当蛋白质含量更高时，用550nm。没有铜离子时，色泽由蛋白质中的酪氨酸及色氨酸残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定，铜离子将肽键聚合在一起，从而加速了电子的传递。

干扰物质较多：柠檬酸，tris，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响。19（2）试剂组成（/hansen/protocols/lowry.htm）LowryA:2%Na2CO3in0.1MNaOH

LowryB:1%CuSO4indiH2O

LowryC:2%sodiumpotassiumtartrate(NaKC4H4O6•4H2O)Lowrystockreagent

49mlLowryA

0.5mlLowryB

0.5mlLowryCFolin'sReagent:Phenolreagent-2N(Folin-Ciocalteaureagent)

主要成分为：3H2O•P2O5•13WO3•5MoO3•10H2O3H2OxP2O5•14WO3•4MoO3•10H2O（/wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent

）Folinphenol试剂还可以测定酚类物质的含量（郑鸿元许光辉李凤珍等.土壤微生物分析方法手册.中国农业出版社，1986.）20（3）该法的历史

吴宪博士[（1893—1959年）是国际著名生物化学家、中国近代生物化学事业的开拓者和奠基人]于1922年发现Folinphenolreagent能测定蛋白质

(Wu,H.(1922)J.Biol.Chem.51,33–39)。

Lowry发现，在此前，先让蛋白质与铜发生发生络合反应（双缩脲法），能提高反应的灵敏度(Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.andRandall,R.J.(1951)J.Biol.Chem.193,265–275）。21第二节蛋白质定性（略）定性蛋白质主要是通过显色反应完成。

常用显色剂：氨基黑10B、溴酚蓝、考马斯亮蓝、酸性品红、氨基萘酚磺酸。另外对于糖蛋白及脂蛋白都有专门的显色剂。

22第三节氨基酸定性一、一般显色反应

茚三酮法：蓝紫色。二、个别氨基酸的显色反应（略）精氨酸的坂口反应、胱氨酸和半胱氨酸的显色反应等。23第四节氨基酸定量一、甲醛滴定法1、原理酸性的-COOH，碱性的-NH2，使氨基酸成为中性的内盐，加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，用碱滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量。2、大约过程加碱中和酸（pH8.2）、加入甲醛，加碱滴定。当加入甲醛后，溶液的pH值还在8.2吗？当样品中存在ＮＨ4+时,则测定结果偏大偏小？如何排除这种影响？24阮富升.铵盐对甲醛法测定酱油氨基氮含量的影响.中国调味品.第8期1999年8月.甲醛不但与氨基酸的氨基起反应,同时也与ＮＨ4+起反应，增加了反应体系的酸性，这部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。因此，以氢氧化钠标准溶液滴定时，会消耗更多的氢氧化钠标准溶液，使氨基氮计算结果升高。4NH4++6HCHO=(CH2）6N4H++3H++6H2O25二、比色法1、茚三酮法氨基酸与茚三酮生成蓝紫色化合物二酮茚胺，该物在570nm有最大吸收（但脯氨酸和羟脯氨酸由于α氨基被取代，生成物显黄色440nm有最大吸收）。26

茚三酮反应的适宜pH为5-7

所有α-氨基酸和蛋白质都有此反应，但有此反应的不一定都是α-氨基酸和蛋白质，比如β-丙氨酸、氨、许多一级胺与茚三酮都呈阳性。（郑继平，汤华，陈银华.现代生物学实验指导.中国农业出版社，2007.）但色泽不一定一样，比如，γ-氨基酸呈黄色，苯胺橙红色。（杨桂法等.有机化学分析.湖南大学出版社，1996.

）27

但课本P140所谈及的及GB/T8314-2002茶游离氨基酸总量测定时：α-氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而纯化。282、邻苯二甲醛法（O-Phthalicaldehyde,OPT)邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，碱性溶液中，与氨基酸产生荧光物质，激发光波长为340nm，发射光波长为455nm。灵敏度比茚三酮高，但荧光强度与氨基酸种类有关，对半胱氨酸、胱氨酸和赖氨酸等的荧光值偏低，和脯氨酸和羟脯氨酸不反应，尿素、尿酸及氨等不发生类似反应。293、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzeneSulfonicacid

）30与茚三酮相比：灵敏度相当，且不受NH4+的影响，但不能与Pro反应，可以和Cys的-SH反应，为此，TNBS前，碱性条件下30℃保温数小时，使-SH都氧化成-S-S-后，再测定。碱性条件下测定的优势是可以用420nm，在可见光范围内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下的优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。314、丹磺酰氯法（dansylchloride）丹磺酰氯是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonylchloride）的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物(激发波长298nm，发射波长546nm），也常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。325、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）法DNFB也叫做Sanger试剂，DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitrophenylaminoacid,DNP氨基酸）331.0mL的0.2mol/LNaHCO3,1.0mL的1%DNFB(1.0mL溶解在100mL的1,4-dioxane)，1.0mL样品液,黑暗处60℃，40min,加入0.5mLof1mol/LHCl终止反应，加入5mL乙酸乙酯萃取，静置10min,420nm测定，氨基酸浓度0.02–1.00mg/mL有良好的线性关系（LinChen，etal.Anovelcolorimetricdeterminationoffreeaminoacidscontentinteainfusionswith2,4-dinitrofluorobenzene.JournalofFoodCompositionandAnalysis22(2009)137–141）。34方法灵敏度脯氨酸、羟脯氨酸受氨的影响茚三酮能反应有影响邻苯二甲醛比茚三酮高不反应不影响三硝基苯磺酸与茚三酮同不反应不影响丹磺酰氯比茚三酮高反应未知2,4-二硝基氟苯比茚三酮高反应未知几种比色法的比较35第五节氨基酸分离及测定一、蛋白质的水解酸水解：5.7mol/L盐酸，密封的水解管中，105-115℃水解20h以上。盐酸水解后，色氨酸全部被破坏。碱水解：5mol/LNaOH，充氮气后填充