常用分子生物学技术的原理及其应用

常用分子生物学技术的原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第9章第一节核酸提取与鉴定核酸分离和纯化的原则：

1、保证核酸一级结构的完整性

2、排除其他分子的污染：蛋白质、多糖、脂类、DNA或者RNA核酸提取的主要步骤为：

裂解细胞—提取核蛋白—去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子—去除盐类、有机试剂等杂质—去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然—沉淀核酸—纯化、干燥基因组DNA提取

SDS/蛋白酶法CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法质粒DNA提取

碱裂解法：NaOH/SDS、KAc或NaAc煮沸法核酸浓度测定

紫外分光光度法：A260

荧光光度法：溴化乙锭嵌入，橙红色荧光—适合低浓度核酸的定量。核酸纯度和完整性鉴定

A260/A280：DNA比值为1.8，RNA比值为2.0A260/A230：比值为2.5，低于2.0说明有碳水化合物污染

琼脂糖凝胶电泳：鉴定是否有污染或者是否有降解第二节分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹

(SouthernBlotting)（二）RNA印迹(NorthernBlotting)（三）蛋白质的印迹

(WesternBlotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。其他：斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)三种印迹技术的比较分子杂交实验①②③放射自显影照片DNA点阵基因芯片工作流程示意图蛋白质样品的制备SDS分离蛋白质转膜特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息Westernblot基本程序第三节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA一、PCR技术的工作原理55555555Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成分PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C引物设计原则

1.

引物的长度一般为15-30

bp，常用的是18-27

bp；

2.

引物序列自身不应该有互补序列，互补碱基应少于四个；3.引物序列的GC含量一般为40-60%，Tm值的计算：Tm＝4(G+C)＋2(A+T)；

4.根据实验目的设计酶切位点，碱基可以和模板不完全配对，但是不配对碱基应≤3个，不配对的碱基应该位于5’端，3’端不能是密码子的第三位，尽量避免是T或A。

TaqDNA聚合酶：对热稳定镁离子依赖性低保真性最适温度为72℃利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突变将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术33mRNA5AAAAAA(n)3mRNA5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5mRNA5cDNA3AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18反转录酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5反转录合成cDNA原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时PCR(real-timePCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。实时PCR技术原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标记引物RQ3'3'5'5'37（四）PCR结合免疫沉淀扩增检测与蛋白质结合的DNA序列7版第四节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理：化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(Sanger法)一、DNA链末端合成终止法GATC

测序反应

电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正极负极ddGddAddTddC链末端合成终止法测定DNA序列的原理二、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。43DNA序列自动分析原理及结果图ddG红ddTddA绿ddC蓝橙毛细管电泳荧光标记DNA合成测序结果展示第五节基因失活技术

基因沉默(genesilencing)是指由外源基因导入引起的生物体内的特定基因不表达或表达受抑制的现象。目前最常用的基因沉默技术包括：RNA干涉或者干扰（RNAinterference，RNAi）反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，ASON）RNAi是指双链RNA介导同源序列的mRNA特异性降解，导致的转录后基因沉默。RNAi是机体的一种天然防御机制，具有防御病毒感染、入侵等功能。目前利用RNAi能够在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点研究基因的功能已成为功能基因组学的热点之一。1.RNA干涉技术可用来研究基因的功能RNAi的作用机制：

外源dsRNA可直接被导入细胞，或者通过转基因、病毒感染等方式进入细胞，并整合到基因组中获得表达；各种来源的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中，特异识别dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约21~23nt的双链小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)；siRNA识别mRNA链上的同源区域之后，结合一个核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducesilencingcomplex，RISC）；RISC定位到靶mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。RNAi的作用机制示意图目前有5种方法可用于制备siRNA：化学合成法体外转录法长链dsRNA的RNaseⅢ体外消化法siRNA表达载体法siRNA表达框架法前3种方法是在体外制备然后导入到细胞中；后两种则是基于具有合适启动子的载体或转录元件，在哺乳动物或细胞中转录生成。目前多采用RNA聚合酶Ⅲ启动子构建siRNA的表达载体或表达框架。将siRNA导入特定细胞，在细胞水平上研究基因的功能；也可以通过转基因的方法，在动物体内实现特异、稳定、长期地抑制靶基因的表达，从而在整体水平上研究基因的功能。已被作为一种简便和有效的工具广泛用于基因功能的研究。缺点：该技术可能对靶基因的相似序列发生作用，导致脱靶（off-targeting）效应。还可能诱导干扰素和其他细胞因子的表达。反义寡核苷酸引发基因沉默的机制：（1）与mRNA前体结合，抑制其成熟；（2）与mRNA的非翻译区结合，抑制翻译；（3）与mRNA的编码区结合，抑制核糖体的前进

（4）抑制成熟mRNA从细胞核到细胞质的转位；（5）使mRNA对核酸酶更敏感，缩短其半衰期。不能排除通过激活细胞内的Dicer酶进入RNA干涉途径而降解靶mRNA。

2.反义寡核苷酸也可引发基因沉默由于反义寡核苷酸技术简便易行，已成为研究基因功能的方法之一。反义寡核苷酸是指能与mRNA互补配对的RNA或者DNA分子，长度一般为20nt左右。核酶某些小RNA分子具有催化特定RNA降解的活性，这种具