SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察

SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察【摘要】(RCC)IIRCC，RCCRCCRCC【关键词】Abstract:ObjectiveToestablishtheseparatingandculturingmethodsforratcostochondralchondrocyte(RCC)，andtoinvestigatetheirmorphouschangesinthecourseofcellpassage.MethodsUnderhelpofcollagenaseIIandtrypsin sdigestion，thescatteredRCCwasobtained.TheobservationofmorphologicalchangesofRCCcellsculturedbymonolayercultureindifferentgenerationswascarriedout.AndthedetectionoftheexpressionofcollagenIIandproteoglycanofRCCcellsindifferentgenerationsbyimmunocytochemicalmethodwasalsoimplemented.ResultsHighpuritycartilagecellswereobtainedfromratcostalcartilagesafterdigestedbycollagenaseIIandtrypsin.Itwasconfirmedbyimmunohistochemistryandtoluidinebluestaining.ThededifferentiationofRCCcellswasobservedwhentheRCCcellswereculturedbymonolayerculture.ConclusionsRCCcellscanbeamplifiedbypassageCulture，butonlywithinthecellsoffourgenerations.Keywords:rat;cartilagecell;monolayerculture;dedifferentiation不具有修复与再生能力。1989Webber[1]的研究结果却显示:软骨细胞能进行自我修复，只是它们的修复能力在体内环境中不能得到激发。2080细胞疗法(cell-basedtherapy)，即移植足够数量的软骨细胞来修复关节软骨的缺损。YanchunLiu[2]偿试应用自体关节软骨细胞为种子细胞，以聚轻基乙酸(polyglycolicacid，PGAPluronic8mm)24周围正常软骨无法区分，新生软骨在组织学、生化组成上与正常关节软骨非常接近，最大抗压能力达到了正常关节软骨的60%以上。本实验拟为软骨种子工程种子软骨细胞的优化获取提供一种有效的可行方法，并探讨其分化能力及分化后的生物学性状。材料与方法材料II(Sigma(HycloneDMEM(Gibco(HERACell);兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(mAb)、PV3～5SD175%医用酒精中，5min×3PBS(含100U/mL21mm×1mm30.25%37℃消化半小时，1DMEM(15%胎牛血清)终止消800r/min5min，20.1%II431次，观察大部分软骨块消化后，15min1次，提取消化细胞悬液镜下观察细胞量足够多后经200目金属筛网过滤，1000r/min10min，25mL15%小牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)重新悬浮细胞，将细胞接种于25mLC1，比例。软骨细胞单层培养及生物学特性动态观察2×104细胞/cm2的密度接种，37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，24h10%2d185%0.25%2×104细胞/cm2，C2……C6。倒置显微镜0.25%胰蛋白酶消化，3.0×104/2438标纸上，得到生长曲线。0.5g100mLPBS0.5%甲苯10%1h，1512～4h，75%1次，90%11次，光镜下观察照相。II695%15min，PBS75%30min，PBS5min，25%BSA1h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加兔抗鼠一抗(1:100)，372h;PBS5min，3SABCSABCSD8h后大多数细胞呈圆形1A);24h后细胞扁平且透亮，边缘出现突起，可见伪足3，6d1B)，80%融合，必须进行97%以上。2～4h细胞较原代培养明显减少，3～42A)，C4，明显的不规则形细胞增多，C62B)。生长曲线的绘制软骨细胞的生长曲线基本呈“S”生长开始增快，C31～37～8C1C4C198%C4C14A、4B)1IIC1IIC4C45A、5B)。50%～7020%～40%，5%～15%IIII则也会损伤细胞。IIIIVVIIXXXI细胞分离开，所以后期需要频繁地进行吹打，其目的是为了使细胞充分地离散。使用该方法获得的细胞行台盼蓝染色后显示，其分离出来的软骨细胞活性达到97%，完全可以作为实验细胞使用。软骨细胞具有高分化特性，但普通单层贴壁培养的软骨细胞在体外其表型难以维持，软骨细胞将会发生一系列的变化:包括形态、表型及相关基因的表达，这过程一般被称为软骨细胞的去分化(Dedifferentiation)现象[3]。本实验在软骨细胞的通过软骨细胞单层培养过程中观察到，在传代过程中细胞的形态逐渐发生了变化，原代的软骨细胞贴壁后在倒置显微镜下细胞多呈多角形、星形、圆形，胞质颜色较深，胞核为圆形，细胞饱满而大。传代至第四代倒置显微镜下观察发现细胞开始呈现不规则形，多数形态表现为近似于细长梭形。第五代梭形变的细胞达到80%。从细胞的形态特征看，软骨细胞梭形变是判断软骨细胞表型是否改变的主要指标[4]。II明显减少，四代以后尤为明显。IIIIC4C1IIII失[5-8]IImRNAIIIMeyerChatterjee[1019784:(1)软骨细胞保持生存;(2)保持活力并持续产生胶原和蛋白多糖;(3)牢固连接;(4)层培养失分化过程中获得增殖能力[11]，所以在需要大量的软骨细胞进行移植的子细胞进行诱导移植。参考文献WebberRJ，YorkJL，VanderschildenJL，etal.Anorganmodelforassayingwoundrepairofthefibrocartilaginouskneejointmeniscus[J].AmJSportsMed，1989，17(3):393-400.LiuY，ChenF，LiuW，etal.RepairinglargepoRCCCinethicknessdefectsofarticularcartilageusingautologouschondrocyte-engineeredcartilage[J].TissueEng，2002，8(4):709-721.ChanCK，AnastassiadesTP.Anionicglycoconjugatesfromdifferentiatedanddedifferentiatedculturesofbovinearticularchondrocytes:modulationbyTGF-beta[J].InVitroCellDevBiol1998，34(6):492-498.HoshibaT，YamadaT，LuH，etal.Nucleardeformationandexpressionchangeofcartilaginousgenesduringinvitroexpansionchondrocytes[J].BiochemBiophysResCommun，2008，374(4):LinZ，FitzgeraldJB，XuJ，etal.Geneexpressionprofilesofhumanchondrocytesduringpassagedmonolayercultivation[J].JRes，2008，26(9):1230-1237.KangSW，YooSP，KimBS，etal.Effectofchondrocytenumberonhistologicalaspectsoftissue-engineeredcartilage[J].MaterEng，2007，17(5):269-276.ParkK，MinBH，HanDK，etal.Quantitativeanalysisoftemporalandspatialvariationsofchondrocytebehaviorinengineeredcartilageduringlong-termculture[J].AnnBiomedEng，2007，35(3):419-428.YangKG，SarisDB，GeuzeRE，etal.Impactofexpansionredifferentiationconditionsonchondrogeniccapacityofculturedchondrocytes[J].TissueEng，2006，12(9):2435-2447.Diaz-RomeroJ，NesicD，GroganSP，etal.Immunophenotypicchangesofhumanarticularchondrocytesduringmonolayerculturebonafidededifferentiationratherthanamplificationofprogenitorcells[J].JCellPhysiol，2008，214(1):75-83.MeyersMH，ChatterjeeSN.OsteochondralTransp