环工微生物实验指导书

10环境工程微生物学试验指导书环保试验室2023年728日试验一 光学显微镜的操作及测微尺的使用一、试验目的把握光学显微镜的构造、原理，学习显微镜的操作方法和保养观看细菌的形态，并学会测量细菌的大小。二、试验原理显微镜的构造和各局部的作用显微镜分机械装置和光学系统两局部(1—1)。(1)机械局部①镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜简有单筒距者使用。345个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。③载物台：载物台是放置标本的平台，中心有一圆孔，片。有的载物台上装有自动推物器。④镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调整器。镜臂有固定式和活动式(可转变倾斜度)两种。⑤镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。(调焦距)各一个。可调整物镜和所需观看的物体之间的距离。(2)光学局部①目镜：一般使用的显微镜具有235l015x5倍、l015倍。观看微生物时常用放大l015倍的目镜。②物镜：物镜装在转换器上，可分低倍镜、高倍镜和10、40、100。物镜的性能由数值孔径(numericalaperture，N．A．)打算，数值孔径n.si/n乘上光线投射到物镜上的最大夹角α物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小打算于物镜的直径和焦距。n是影响数值孔径的因素，显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。⑦聚光器：聚光器安装在载物台的下面．反光镜反射来的光线通过聚光器被聚拢成光锥照耀到标本上，可增加照明度，造成适宜的光锥角度，提高物镜的区分力。聚光器可上、下调整，以求得最适光度。案光器还附有虹彩光圈，推动把手可随便调整透进光的强弱。合理调整案光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清楚的图像。④反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯使用的是电光源。⑤滤光片：可见光由各种颜色的光组成，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色，分别透过不同波长的可见光，可依据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。三、试验装置与设备试验设备生物显微镜。测微尺四、试验步骤显微镜使用方法(1)低倍镜的使用法置显微镜于固定的桌上。旋动转换器，将低倍镜移到镑筒正下方，和镜筒对直。转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜认真观看，使视野亮度均匀。将标本片放在载物台上，使观看的目的物置于圆孔正中。将粗调整器向下旋转(或载物台向上旋转)，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。0.5cm处时停顿旋转。左眼向目镜里观看，将租调整器向上旋转，假设见到目的物．但不格外清楚，可用细调整器调整，至目的物清楚为止。假设粗调整器旋转得太快，使超过焦点，必需从第e步重调，不应正视目镜状况下调粗调整器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。观看时两眼同时睁开，如用左眼看显微镜，有眼看桌上纸张，便可一面看一面画出所看到的物像。高倍镜的使用法①使用高倍镜前，先用低倍镜观看，觉察目的物后将它移至视野正处。②旋动转换器换高倍镜，假设高倍镜触及载玻片应马上停顿旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。假设调对了,换高倍镜时根本可以看到目的物假设有点模糊，用细调整器就清楚可见。油镜的使用方法①假设用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。②在载玻片上滴一滴香柏油(或液体石蜡)，将油镜移至正中使油镜镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调整器微微向上调(切记不用粗调整器)即可。③用油镜观看完毕，用擦镜纸将镜头上的油擦净、纸蘸少许二甲苯擦试镜头，再用擦镜纸揩干。显微镜的保护法①显微镜应放在枯燥的地方，使用时需避开猛烈的日光照耀。②物镜和目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩干。③用完显微镜后，应当马上放到镜匣中。目测微尺、物测微尺及其使用方法5mm50格(100格)用时放在目镜内。物测微尺物测微只是一厚玻片。中心有一圆形盖玻片。中心刻有1mm长的标尺，等分为10010um，用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。目测微尺的标定将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再求出高倍镜下目测微尺每格的长度。菌体大小的测量将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数l格的长度算出菌体的长度和宽度。细菌个体形态的观看严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序观看各示范片，并用铅笔分别绘出其形态图。选择一种细菌，量出其尺寸。五、试验结果1．结果分别绘出在显微镜下观看到的细菌形态，及细菌的尺寸。六、试验结果争论(1)?(2)用油镜观看时．为什么要在载玻片上满加香柏油?(3)为什么目测微尺必需用物测微尺标定?在某一放大倍数下，标定了目测微尺，假设放大倍数转变，它还需重标定吗?试验二原生动物及微型后生动物的观看一、试验目的建立对活性污泥及常见微生物的感性生疏，把握微生物活体观看技术；把握依据微生物种类数量判别活性污泥的状况。二、试验原理据其种类和数量可判定活性污泥的活性。三、试验装置与设备显微镜。活性污泥。取自污水处理厂曝气池。l00mL四、试验步骤肉眼观看取曝气他的混合液置于100ml性能(30min制片取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在干净的载玻片中心(如混合液中污泥较少，可加盖玻片时应使其中心已接触到水滴后才放下，否则会在片内形成气泡，影响观看。镜检在显微镜下低倍或高倍下观看生物相。污泥茵胶团絮绒体外形、大小、稠密度等。丝状微生物伸出絮绒体外的多寡。微型动物微型动物的识别参阅教材。五、试验结果列举镜检的主要生物相，并绘制其生物图。六、试验结果争论依据试验观看状况，试对污水厂活性污泥质量及运行状况作初步评价。试验三 微生物细胞的计数一、试验目的把握血球计数板的原理和使用方法；能娴熟使用血球计数半对微生物细胞悬液进展细胞计数。二、试验原理血球计数板(图3-1)是由一块比一般玻片厚的特制玻片制成的。玻片中心刻有四条槽，中心两条槽之间的平面比其他平面略低，中心有一小槽，槽的两边的平面上备刻有9个大方格，中间的一个大方格为计数室，它的长相宽各为1mm0.1mm0.1mm3。计数室有两种规格：16254002516400(1)16x25细胞数／m1＝〔100/100〕x400xl0xl000x(2)25x16细胞数／m1＝〔80小格细胞数/80〕x400xl0xl000x三、试验装置与设备显微镜、血球计数板、移液管、酵母菌液。四、试验步骤稀释样品。为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含5个细胞。取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中心的计数室，用移液管吸取少许充分格匀的待测苗液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置5—10min、下旋动细调整器，以便看到计数室内不同深度的菌体。现以16x25l0025x1680母菌只计格的上方及左方线上的酵母茵，或只计下方及右方线上的酵母菌。31m1五、试验结果将试验结果计入下表：重复试验重复试验45菌液浓度〔个/ml〕菌数123平均六、试验结果争论试验四微生物纯种分别及初步鉴定〔综合性试验〕一、试验目的该综合性试验包括以下内容：培育基的配制与高压蒸汽灭菌：目的是让学生建立微生物养分的概念，把握养分琼脂培育基的制备方法和灭菌原理、方法，初步建立微生物试验的“无菌操作观念细菌纯种分别、培育和接种技术：目的是让学生把握从环境中分别微生物纯种，把握纯种菌种的培育接种技术〕进一步树立无菌观念，学会无菌操作的试验技术。细菌纯种的菌体、菌落形态的观看：目的是让学生建立对细菌菌落的感性生疏，把握对细菌菌落形态的描述方法，并通过菌落特征初步对细菌进展分类。微生物的染色：目的是让学生把握细菌革兰氏染色的原理及方法，对细菌进展革兰氏染色的阴阳性鉴定。过氧化氢酶的定性测定：通过此试验对纯种分别的细菌进展过氧化氢酶的阴阳性判定，加深对细菌胞外酶催化生物化学反响的感性生疏。二、试验装置与设备培育基的配制与高压蒸汽灭菌：(1)培育皿(直径90mm)、试管、吸管、锥形瓶、烧杯(2)纱布、棉花、报纸、牛皮纸。pH10％HCl、10％NaOH。牛肉膏、蛋白胨、氯化纳、琼脂、蒸馏水。(5)高压蒸汽灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。细菌纯种分别、培育、接种技术、菌落观看：(190cm)101ml210m11(2190mLl9mL5(3)接种环、酒精灯、恒温箱。3.革兰氏染色显微镜、香柏油(或液体石蜡)、二甲苯、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯。草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、番红染液。三、试验步骤培育基的配制与高压蒸汽灭菌：玻璃器皿的洗涤与包装洗涤玻璃器皿在使用前必需洗涤干净。培育皿、试管、锥形瓶等可用去污粉或肥然晾干或放入烘箱中烘干备用。包装①培育皿由一底一盖组成一套，按试验所需的套数一起用皮纸包装。l-1.5cm〔4—5cm30叠包装纸包住移液管的尖端(图4-1)，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋③试管和锥形瓶等的管日或瓶口均需用棉塞堵塞。棉塞不宜过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞的2／3应在管内或瓶口内，上端露出少许，以便拔塞。棉塞的大小及外形应如图4—2所示。待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包裹，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内(用纸包裹是为了避开灭菌时冷凝水淋湿棉塞)，以备灭菌。培育基的制备(1)步骤①配制溶液：取肯定容量的烧杯盛入定量无菌水，按培育基配方(见附录三)逐一称取各种成分，依次参加水中溶解，难溶的物质，例如蛋白陈、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补充加热蒸发的水量。加热对应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。②调整PHPH试纸测定培育基溶液的pH。按要求以l0％Hcl10％NaoHPH。③过滤：用纱布、滤纸或棉花过滤均可。如培育基内杂质很少，可省略过滤。4-3基沾污管口或瓶口，避开浸湿棉塞引起杂菌污染)，装入试管的培育基量1/4—1/3。⑤斜面培育基的制作：将装有琼脂培育基的已灭菌的试管趁热取出，斜置于木棒(或橡皮管)上，使试管内的培育基斜面长度为试管长度的l/3—1/24-4)。(2)养分琼脂培育基的制备①培育基配方：牛肉膏0.75g，蛋白陈1.5g，0.75g，琼脂3g，蒸馏水150mL，pH7.6。0.1MPa20min。②操作：300ml150m1足蒸发损失的水量。用10％NaOH调整pH7.6，本试验省略过滤。将培育基分装5250ml无菌水的制备250m190(99)ml518mm×180mm9mld．灭菌菌有些不同，它是用物理、化学因素杀死局部或全部微生物的养分细胞及一局部芽抱。灭菌的操作过程①使用前，先在灭菌锅内参加适量的水．然后把灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺栓，以防漏气。②在灭菌锅底部加热、同时翻开排气阀、待自徘气阀冒热气3—5min后关闭。至压力表所示压力升至所需压力时开头计时。通过调整热源，而维持肯定的疙力。到达灭菌时间后，停顿加热。③待锅内蒸汽全部排完后〔压力表示零)，方可翻开排气阀，翻开锅盖，取出灭菌物。力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培育基而发生污染。372细菌纯种分别、培育、接种技术、菌落观看：平板划线分别法5010-15ml倒入无菌培育皿内，使凝固成平板。时左手持培育皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜4-53048h观看结果。接种斜面培育基接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上。将试管贴上标签，注明接种日期、接种人、组别、姓名等。点燃酒精灯。先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。在火焰旁，右手持经酒精灯灭菌冷却的接种环(环以上但凡可能进入试管的局部都应灼烧)，同时左手持培育皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，许菌种，将接种环停留在无菌范围内，放下平板，拿起待接种试管，用右手小指、无名指和烧掉。将挑取菌种的接种环伸入试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环管塞上棉塞并插在试管架上，最终再次烧红接种环，则接种完毕，置于30℃恒温箱中培育24-36h菌落形态特征的观看由于微生物个体外表构造、分裂方式、运动力量、生理特性及产生色素的力量等各不相的菌落特征，可粗略区分是何种类型的微生物。应留意菌落的外形、大小、外表构造、边缘构造、菌丛高度、颜色、透亮度、气味、粘滞性、质地软硬状况、外表光滑与粗糙状况等。通常，细菌菌落多为光滑型，潮湿，质地软、外表构造特征很多，具各种颜色。但也有枯燥粗糙的，甚至呈霉状但不起绒毛。酵母菌菌落呈圆形，大小接近细菌，外表光滑，质地软，颜色多为白色和红色。放线菌的菌落硬度较大，枯燥致密，且与基质结合严密，不易被针挑取。菌落外表呈粉状或皱折，呈龟裂状，具有各种颜色，且正面和反面颜色不同。霉菌菌落长成绒状或棉状，能集中生长，疏松，用接种环很易挑取。对微生物在斜面培育基上生长的特征进展具体的观看，观看菌落生长旺盛程度、外形、颜色及光泽等。革兰氏染色