第十一章维生素及辅酶类药物

1VC的生产工艺22雌甾烷雄甾烷孕甾烷

13-CH310-CH310-CH3

13-CH313-CH3

17-C2H5

181918181920212.甾体激素药物的分类与药理作用（1）从化学角度分类33

菌种孢子制备种子罐发酵罐过滤提取液结晶滤液底物溶解溶料罐滤饼提取液结晶1、甾体药物的生物转化生产工艺流程：44转化方法①一步发酵转化法（边发酵边转化），是我国目前甾体医药工业普遍采用的微生物转化法。②静息细胞、干细胞或孢子悬浮液法；③多菌种协同转化法；④固定化细胞或固定化酶转化法

⑤双水相系统转化法⑥有机相介质转化法55③氢化可的松生产工艺流程及主要工艺参数

茄子瓶

28℃,5d

孢子悬浮液

1%接种量种子培养基种子培养

28℃，0.06MPa250r/min,25M3/h,19-21h

发酵培养基发酵培养

10%接种量,28℃，0.06MPa160r/min,40-60M3/h,12-13h底物RSA溶解罐氧化反应

28℃，160r/min,周期30-40h,40-150M3/h

离心过滤发酵液粗品提取醋酸异丁酯(7:1)

氢化可的松粗品分离甲醇和二氯甲烷(14:86)

氢化可的松精品结晶,精制乙醇,活性炭

干燥氢化可的松成品66种子标准：菌丝量1/3-1/2，种龄19-21h，在试管中下沉（5min），呈芝麻粒状,pH4.1-4.6左右，镜检无杂菌发酵菌体标准：菌丝体积占1/2-2/3，pH3.8，菌龄12-13h，镜检菌体生长良好,无杂菌氧化过程：转化周期30-40h，过程检测放罐标准：pH6.4-7.0，H2SO4显色<1级成品标准：外观白色或几乎白色，熔点≥208℃，干燥失重≤1.0%，比旋度+162°-169°，含量≥98.5%培养基：种子培养基:玉米浆1.25%,酵母膏0.23%,硫酸铵0.3%,葡萄糖1.05%；pH6.4-6.7发酵培养基:玉米浆1.20%,酵母膏0.25%,硫酸铵0.5%,葡萄糖1.05%;pH6.4-6.7底物投料方式：填加有机溶剂-乙醇RSA:工业酒精（80%-85%）=1：18注意：回流溶解，加热过猛不利于底物溶解和生物转化④氢化可的松生物转化工艺主要控制要点77③醋酸泼尼松的工艺流程C1,2位脱氢反应化学合成：以SeO2为催化剂，转化率为65%生物转化：以简单节杆菌为生产菌种C1、2位脱氢酶。专一性高，转化率为97%以上。88④生物脱氢工艺的主要操作要点种子标准：1%TTC染色，菌液呈1min变色，3min变红，15min变紫；镜鉴无杂菌；透光率10-25%；pH7.2-7.5。底物投料方式：直接投料，然后加7%酒精，投料浓度4%。生产菌种：简单节杆菌（Arthrobactersimplex

）存在分形现象：对数期形态细长，呈杆状，菌体逐渐变短变粗，衰老后变球状。转化终点的判断：TLC法。转化时的重要工艺参数：pH值6.5-7.0脱氢酶(红色)TTC(2、3、5-氯化三苯基四唑)TF三苯基四臢99②沃式氧化物C11α-OH生产工艺流程茄子瓶孢子悬浮液种子培养（2.5T）27±0.5℃，0.06MPa，20h发酵培养（20T）27±0.5℃，0.06MPa，22h氧化反应24h离心过滤滤饼提取浓缩、结晶、过滤精制浓缩、结晶、过滤干燥成品甲苯：氯仿（1.88倍）丙酮4.5倍溶解底物：丙二醇=1：25（1-1.5h）1010种子标准：菌丝体积1/2以上，上浮力强，pH4.1-4.3,镜检无杂菌发酵菌体标准：菌丝体积占1/2-2/3，pH3.8,镜检菌体生长良好，无杂菌。③沃式氧化物C11α-OH生产工艺主要操作要点底物投料方式：底物：丙二醇=1：25（1-1.5h）转化终点的判断：TLC法种子、发酵培养基：葡萄糖2.5%，玉米浆2%，蚕蛹粉0.2%，硫酸铵0.05%，（聚醚0.06%），PH4.5。11思考题简单节杆菌能催化17-甲基睾丸素C1,2脱氢生成17α-去氢甲基睾丸素（美雄酮），试根据所学知识设计一条合理的生产工艺，列出一般工艺流程，标明该工艺控制的环节。12掌握维生素和辅酶的基本定义和特点；了解维生素和辅酶药物的种类和生产方法。了解几种重要维生素和辅酶药物的生产工艺，掌握维生素C的生产工艺、关键工序和控制要点；了解维生素和辅酶类药物的发展趋势。第十一章维生素及辅酶类药物131、定义：

维生素（Vitamin）：是生物体内一类量微、化学结构各异，具有特殊功能的小分子化合物，它们大多需要从外界摄取。一、维生素的基本概念

第一节维生素及辅酶2、特点：（1）参与生物生长发育和代谢所必需的一类微量有机物质;（2）需求量很小，每日仅以mg或ug计;

日需量：VA0.8-1.7mg；VB11-2mg；VB21-2mg；泛酸3-5mg；VB62-3mg；VD0.01-0.02mg；叶酸0.4mg；生物素0.22mg；

VE14-24mg；VC60-100mg；。14（3）在体内不能合成或合成量不足，必须由食物供给;（4）绝大多数以辅酶或辅基形式参与体内酶促反应体系，在代谢中起调节作用;（5）“维生素缺乏症”;烟酸—癞皮病；VB1—脚气病；VA—夜盲症；VC—坏血病（6）在生物体内的作用，不同于糖类、脂类或蛋白质，不作为C、N或能源;不用来供能或构成生物体的组成部分，但是代谢过程中必需的。另外，有些化合物，具有生物活性，有人称之为“类维生素”，如类黄酮、肉碱、牛磺酸等。15161718小分子化合物，结构上差异很大4、维生素的分类⑴溶解性区分脂溶性：包括维生素A、D3、D2、E、K，溶于脂肪及有机溶剂，在食物中常于脂类共存水溶性：包括B族维生素（B1、B2、B6、PP、B12、叶酸、泛酸、生物素等）和维生素C，溶于水⑵化学结构：无共同性脂肪族、芳香族、脂环族、杂环和甾类化合物等3、命名：

Vitamin：V加上拉丁字母。多种混合再加上1、2、3等数字，按发现的先后顺序命名例如：1913年美国化学家Mendal和Osborni发现了VAMcCollum和Davis发现了VB19二、维生素与辅酶、辅基的关系维生素与辅酶、辅基的关系辅酶（coenzyme）:与脱辅酶结合松弛的小分子有机物(通过透析可以除去，如辅酶1和辅酶2)。辅基（prostheticgroup）:以共价键结合，需一定化学处理才能与蛋白质分开。如FAD、铁卟啉。本身是辅酶或辅基的组成部分酶：简单蛋白质结合蛋白质：酶蛋白辅因子：辅酶辅基金属离子20三、维生素的国际市场2001年我国VH投产，成为世界上能生产全部维生素品种的国家之一。14种维生素全部实现了国产化，其中VC

、VB2国际领先。2002年形成三足鼎立局面：我国+其它30%，瑞士罗氏40%；德国巴斯夫（兼并日本武田）28%

罗氏是全球最大的维生素产品生产和经营商，占整个维生素市场的40%;巴斯夫（脂溶性产品）。我国维生素整体产业：

①技术成熟，需求稳定而有潜力，市场透明度大。

②产量高，品质全，规模大，生产工艺先进，价格具有竞争力。2004年20亿＄：VC5亿＄；VA5亿＄；VE10亿＄VE：浙江新和成股份有限公司1996年生产2001年产量达万吨，2003年产量达两万顿。2002年出口8883万$,2003年达1.28亿$，增加了44.6%VA：企业不多，产量偏小→同上，1999年投产2000t/a

2011年：产量24万吨，产值28亿美元，出口21万吨（未包括氯化胆碱12.5万吨）

212223242526第二节维生素辅酶类药物的生产方法化学合成法：

烟酸、烟酰胺、叶酸、硫辛酸、VB1、VB6、VD、VE、VK等微生物发酵法：

VB1、VB2、VC和生物素、β-胡罗卜素生物提取法：辅酶Q，芦丁，VB12

一、概论27重要的维生素及辅酶类药物

28二、重要维生素及辅酶类药物的生产方法和工艺

1.维生素B2①核黄素（Riboflavin）,水溶性的。

主要生理功能：合成核黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），作为氧化还原酶的电子受体。缺乏症：皮炎人用0.3～1.8mg/d；用于动物饲料。②生产方法：化学合成占主要地位。收率最高为60%，并产生大量废物。需要大量的有机溶剂和高耗能。发酵法，总产量3000吨以上。29生产菌种：阿氏假囊酵母(Eremoteciumashbyii)15g/L棉阿舒囊菌(Ashbyagossypii)15g/L假丝酵母（Candidafamata）20g/L[美]ADM公司枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）

基因工程菌株

（苏联构建）缺点：需严格控制Fe2+，15μmol/L以下，防止抑制作用。优点：生长快，核黄素合成与菌体的生长无联系。302.维生素C人、猴、豚鼠在肝脏中缺少古洛内酯酶（L-gulonolactoneoxidase）,不能在体内合成。坏血病表现：毛细管脆弱，皮肤出现小血斑，牙龈发炎出血，牙齿动摇等。（1）概述：VitaminC，又称抗坏血酸（Ascorbicacid），C6H8O6：176.13化学名：L-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ内酯熔点：191～192oC,比旋光度：+20.5‘～+21.5’；紫外吸收最大值：245nm

pH:2.4～2.8,溶液消光值：≤0.01透光度：3g/15ml,细度：≥50%（40-80目）31又名抗坏血酸（Ascorbicacid）是细胞氧化-还原反应中的催化剂，它释放两个氢原子后变成氧化型维生素C，有供氢体存在时，脱氢抗坏血酸可以接受两个氢原子变成抗坏血酸，参与机体新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。用于防止坏血酸和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合，以及用作辅助药物治疗。水溶性、酸性、还原性、水解性水溶性：易溶于水酸性：具有较强的还原性，加热或在溶液中易氧化分

解，在碱性条件下更易被氧化，为己糖衍生物

还原性：具有较强的还原性，维生素C可以是氧化型，又可以是还原型存在于体内，所以可作为供氢体，又可作为受氢体，在体内氧化还原过程中发挥重要作用。

水解性:易水解32维生素C的生理作用：33维生素C的应用：34（2）生产方法

化学合成法：莱氏法(1933年德国化学家莱奇司登Reichstein发明），转化率60%左右

60’世界各国→简化‘莱氏法’研究，但目前仍处于实验室阶段；

全化学合成法：三步全化学合成法葡萄糖或葡萄糖内酯→丙酮化→催化氧化→水解→Vc

特点:丙酮用大,需要铂做催化剂,收率25%-28%(很低)

二步发酵法→70’年代中科院微生物所尹光琳等和北京制药厂等单位共同发明；转化率80%左右,收率47%-55%；

80年代初上海第二制药厂中试成功并首先投入生产；

发酵法

新二步发酵法:1983年日本盐野义制药公司园天高康提出,

葡萄糖串联法,欧文式菌+棒杆菌,总转化率84.6%

葡萄糖→2,5-二酮葡萄糖酸(2,5-DKG)→2-酮基-L-古龙酸→Vc一步发酵法：基因工程菌

D-葡萄糖→2-KLG，转化率49.4%参考书：焦瑞身主编,《微生物工程》.北京:化工出版社，2003年7月,P208-22035①莱氏法：反应途径

36①莱氏法：工艺特点

以D-山梨醇为原料，经黑醋菌（Acefobactermelanogenum），一步发酵得L-山梨糖，再经丙酮酸缩合，经氯酸钠氧化及盐酸转化等5步制备Vc。主要步骤有5步，工艺成熟，总转化率60%左右。缺点：生产工序繁杂，反应剧烈，对设备要求高，劳动强度较大，环境压力大（使用了大量的有毒、易燃易爆化学品，如丙酮，次氯酸钠）1molD-葡萄糖(分子量180)

→1molVc(分子量176)，理论转化率98%，但实际上由于分子重排，3个H和1个O不可能来源于葡萄糖，实际转化率低得多，总转化率在60%左右。37②二步发酵法：反应途径O3839混合菌株第二步发酵是关键，D-山梨醇是发酵的主要原料。第一步发酵成的L-山梨糖（发酵液）于80oC加热10min(或不加热)，再加入辅料（玉米浆、尿素和无机盐）进行第二步发酵。初期pH7.0，定期加入碱液调pH以保持产酸的正常进行。发酵终了，pH7.2，温度略升高。此时，L-山梨糖已耗尽，“大菌”游离，芽孢及残存菌体已逐步自溶，整个发酵过程结束，发酵液经提取、化学转化和精制→Vc的成品。以生物氧化代替化学氧化，创造了具有中国特色的技术路线，二十多年来，菌株性能一直很稳定，发酵转化率80%左右，Vc总转化率47%，最高可达55%，处于世界领先水平。维生素C生产的二步发酵法主要发明人：中科院微生物研究所：尹光琳，陶增鑫，严自正，北京制药厂：宁文珠，王长会，王书鼎②二步发酵法：工艺特点40A、生产菌种一步发酵用菌：D-山梨醇L-山梨糖国外：生黑葡萄糖醋杆菌（Gluconobactermelanogenus）,

工厂通称“黑醋菌”。

国内：R-30,A-1,S-7,N0-3,

其中R-30，N0-3具有抗噬菌体特性的高产菌。其他菌株：弱氧化醋酸杆菌（Acetobactersuboxydans）一步发酵终点：TLC分析，无醇斑点，发酵率》96%（摩尔分数）氧化②二步发酵法：工艺要点

两步发酵用菌：L-山梨糖2-酮基-L-古龙酸混合菌株：产酸“小菌”AS1.945→SCB329

伴生“大菌”搭配组合而成混合培养氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans)巨大芽孢杆菌(bacillusmegateriun)

条纹假单胞杆菌

41

伴生菌作用：促进小菌旺盛发育和大量产酸,参与整个生物氧化过程。本身单独不能利用L-山梨糖产酸，在芽孢开始时达到产酸量高峰。SCB329-SCB933组合菌系：

工业L-山梨糖发酵产酸率83.99%L-山梨糖酵液产酸率85.50%。①二者之间的合理搭配是工艺成功的关键②在混合培养发酵中，伴生“大菌”生成芽孢时达到产酸高峰，游离芽孢自溶后产酸量下降。掌握大小菌生长特征和生理生化特征是发酵正常的关键。42

B、生产菌种的培养发酵条件分批发酵条件：

发酵培养基含量80g/L山梨糖，

接种量5%

通气1：0.8～1：1.0

溶氧25%～30%

温度28±2oCpH6.7～7.2（流加30%NaOH调节）

搅拌速度：200r/min（初始），根据溶氧不超过1000r/min

中间检测：4～8h取样1.观察菌体形态2.测定残糖量和2-KLG

放罐：残糖<5g/L(工厂控制：<1g/L）43B、生产菌种的培养发酵条件流加发酵条件：1.解除底物抑制；

2.避免一次投糖过多造成细胞大量生长（耗氧过多往往造成通风搅拌的设备匹配不足）优越性

初始L-山梨糖30～50g/L,其他相同。

补糖：第一次:发酵8～10h时，总糖达100g/L左右，并略提高pH和温度第二次:发酵20～24h时，总糖达140g/L左右

放罐：残糖<5g/L(工厂控制：<1g/L）;

发酵周期：40-50h；

2-KLG产量：115～130g/L，

转化率：88%（摩尔分数）。44①依靠pH的调节来调节：从产酸高峰起，随2-KLG的提高，适当提高pH有利于产酸。②生长温度二者稍有差异,依靠温度来调节:不仅影响二者的生长速率，还影响大菌芽孢的形成。

小菌：25～30oC;大菌：28～37oC③依靠溶氧来调节（关键因素）2-KLG发酵：高耗氧性

小菌：对缺氧很敏感，要保持较高溶氧水平，过长时间缺氧，可降低菌体代谢、繁殖和生长能力，以及产酸水平，或种子发酵。大、小菌生长速度和比例的调节：

关键点：①大小菌的合理搭配早期“大菌”以营养体为主，出现芽孢即开始产酸镜检：发酵液中“大菌”