核酸代谢之DNA代谢

第十二章核酸的生物合成

之DNA的生物合成一、DNA指导下的DNA合成DNA复制受控于一套基本规则:1.复制是半保留复制2.复制从一个起点开始,通常向两个方向进行3.DNA合成的5′→3′方向性及半不连续性DNA复制DNA的半保留复制—Meselon-Stahl实验:(a)细胞在只含有[15N]的培养基中培养数代,这样其DNA中含的N全部为[15N],在氯化铯密度梯度离心后得到一条带(蓝色)(b)细胞转移到只含有[14N]的培养基中培养一代后,分离出DNA进行氯化铯密度梯度离心,得到一条密度在[15N]DNA和[14N]DNA之间的带(紫色)(c)复制的第二代产生2个杂化DNA,2个”轻”DNA(红色)DNA双向复制可视图(JohnCairns放射自显影实验)(a)用3H(氚)标记DNA链,表明两条链是同时复制的(红色表示新合成的链),大肠杆菌在电子显微镜下观察到的复制过程正好与放射自显影上所显示的相符DNA双向复制可视图(JohnCairns放射自显影实验)(b)在复制过程结束前加入3H,通过放射自显影观察标记(红色),在复制叉的两侧还是一侧,从而断定复制是双向还是单向.利用这项技术已证实大肠杆菌枯草杆菌及其他细菌都是双向复制的.DNA复制的5′→3′方向性及半不连续性新的DNA链(红色)总是沿着5′→3′方向合成.摸板则是沿着相反的3′→5′方向配对.前导链沿着复制叉的方向连续进行合成.而后一条链,后随链的合成则是不连续的,复制方向与复制叉移动方向相反,且形成许多不连续的片段(冈崎片段),最后这些冈崎片段通过DNA连接酶形成一条完整的DNA链.DNA复制过程中需要许多酶和蛋白质因子(DNA复制酶系统)的参与DNA复制酶系统(DNAreplicasesystem)或复制体(replisome)：解旋酶(helicase)拓扑异构酶(topoisomerase)或DNA旋转酶(gyrase)DNA结合蛋白(DNAbindingprotein)引物酶(primase)DNA聚合酶(DNApolymerase)DNA连接酶(DNAligase)DNA的超螺旋结构拓扑应力现象DNA聚合酶DNA聚合酶的作用特点：1.基本反应:通过增长的DNA链的3′末端核苷酸的3′-OH对即将引入的5′-脱氧核苷三磷酸的5′-α-磷酸进行亲核进攻实现。2.DNA聚合反应需要有引物(Primer)。

引物:一条与模板链互补的线性片段,其上带有能与核苷酸相结合的游离3′-OH,这个羟基位于引物的3′末端,因此称为“引物末端”(primerterminus)。3.能保证DNA复制的精确进行。DNA链的延伸:引物链必须提供3′端的游离羟基,在此处一个新的核苷酸单元被加入.每个增加的核苷酸部分通过碱基配对被模板上合适的核苷酸选择.反应产物具有新的游离3′OH,允许另一个核苷酸的加入.DNA复制的忠实性依赖于碱基对的几何性质(a)标准A=T和C=G碱基对具有相似的几何性质,结合一个碱基的活性部位(蓝色)一般接纳另一个对应碱基(b)不正确配对碱基的几何形状可从活性部位剔除DNA复制的精确性DNA聚合酶I的3′→5′外切酶活性校正错误保证了DNA复制的精确性:当DNA聚合酶沿着DNA移动时,其外切酶活性先起聚合酶活性作用,一旦有错配序列的碱基对阻止了DNA聚合酶I向下一个位置移动时,它就向后滑动,以其3′→5′外切酶活性校正错误,然后按5′→3′方向恢复酶的聚合活性.大肠杆菌DNA聚合酶I、II、III的比较大肠杆菌DNA聚合酶III的各个亚基组成DNA聚合酶III的两个β亚基形成一种环形夹子，把DNA分子包围起来，夹子沿着DNA滑动，防止其从DNA上滑落，使其酶连续合成能力提高500000以上。DNA复制过程中的切口平移：与模板配对的一段DNA或RNA可同时被DNA聚合酶I上的5′→3′外切酶降解和替换。酶的这些活性对复制过程中的DNA修复和RNA引物的去除均有作用。去除的核酸链(DNA或RNA)用绿色表示，替换的用红色表示。切口处断裂的磷酸二酯键留下游离的3′OH及游离的5′磷酸基，出现在DNA合成起始位置，DNA聚合酶I延伸非模板DNA链，沿DNA平移切口，该过程叫切口平移。切口留在DNA聚合酶I解离处，直到被另一种酶封闭。DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)三维结构图Klenow片段由聚合酶I经蛋白酶酶解去除5′→3′外切酶活性后产生,保持酶的聚合及校正活性.该片段来自耐热菌株.添加核苷酸的活性部位很深位于结合DNA的远端裂缝.深蓝色链是模板.大肠杆菌复制起始位点oriC的序列分布：尽管重复的序列(有颜色的)不完全一样，但在每个位置上，一些核苷酸是共有的，形成了保守序列。大肠杆菌染色体的复制步骤起始：复制起始位点(oriC)；高度保守序列延伸终止大肠杆菌染色体复制的终止：终止序列(Ter)位于染色体上方向相反的两簇；方向相反的两个复制叉分别进行DNA复制，产生完整的交联在一起的染色体(或拓扑互连的环状染色体)，分离交联环时，需要拓扑异构酶的作用。真核细胞DNA的复制与原核细胞DNA复制的不同多个复制起始位点复制叉移动速度较慢DNA聚合酶至少包括α、β、γ、δ和ε五种端粒的复制：端粒酶(反转录酶，RNA部分和蛋白质部分)，反转录过程酵母染色体中的重要结构元件端粒位于真核生物染色体的两端，帮助稳定染色体。其末端为约100个碱基对的序列，大致由5′(TxGy)n和3′(AxCy)n序列重复而成，x和y通常介于1和4之间，n为端粒的重复数目，在真核单细胞染色体中为20～100，在哺乳动物中常常超过1500。端粒的重复序列主要是通过端粒酶加到真核染色体的末端的。(c)返回到内部模板RNA的原位，以添加更多的TG残基端粒的复制过程(a)端粒酶内部模板RNA与DNA的TG引物(TxGy)通过碱基配对结合(b)端粒酶添加更多的T和G残基到TG引物上互补的CxAy链被认为由RNA引物起始，被细胞DNA聚合酶催化合成。在很多低等真核细胞中，单链区由一些特殊的结合蛋白保护，特别是那些端粒少于几百个碱基对的种类。在端粒长度有几千个碱基对的高等真核细胞(包括哺乳动物)中，单链末端被一种称作T环(Tloop)的特殊结构所封闭，单链末端回折，并与端粒双链中的互补部分配对。小鼠肝脏细胞中染色体末端的T环电镜图在哺乳动物中，该DNA环与两种称为TRF1和TRF2的蛋白质结合，这两种蛋白质与T环形成相关。T环保护了染色体的3′端，使之不受核酸酶及修复双链损伤的酶的作用。端粒酶活性的缺失会导致每一代细胞分裂时端粒的逐渐缩短，最后导致细胞系死亡。在生殖细胞中，有端粒酶活性，端粒长度可维持；在缺乏端粒酶的体细胞中，端粒长度无法维持。人类体细胞的端粒长度随个体年龄的增加而变短。如果端粒酶的反转录酶在体外引入人体细胞，端粒酶活性恢复，细胞寿命显著增加。端粒的逐渐变短与衰老过程的关系、人类寿命长短与端粒长度的关系，将揭示一些奇妙的内容。生物细胞DNA复制分子机制

的基本特点复制是半保留的复制起始于特定的起始位置，真核生物有多个起始点复制可以朝一个方向也可以朝两个方向进行，后者更为常见复制时，DNA的两条链都从5′端向3′端延伸复制是半不连续的，前导链是连续合成的，后随链是不连续合成的，即先合成冈崎片断，再连接起来构成后随链。二、一种特殊的DNA合成方式：RNA指导的DNA合成致癌RNA病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶(反转录酶)反转录病毒感染哺乳动物细胞并整合到宿主染色体的过程单链RNA病毒基因组和反转录酶进入宿主细胞，反转录酶首先催化合成一条与病毒RNA链互补的DNA链，然后降解RNA-DNA杂合分子中的RNA链并以DNA链取代它，最后形成的双链DNA通常要整合到宿主细胞的基因组中。这些整合的并且休眠的病毒基因组能被活化合转录，进一步包装成新的病毒。反转录酶催化的反应：

RNA依赖的DNA合成

RNA降解

DNA依赖的DNA合成病毒反转录酶引起癌症和艾滋病大多数病毒反转录酶不能杀伤宿主细胞，但能整合于细胞DNA内，刺激细胞分裂。有些反转录病毒属于RNA肿瘤病毒，含有能引起细胞异常生长的致癌基因。Rous肉瘤病毒(鸟肉瘤病毒)基因：在正常鸡DNA及许多其他真核生物包括人类的基因组中均发现这种基因。当受Rous肉瘤病毒感染时，致癌基因能高水平表达，促进细胞不规则分裂并导致癌症。HIV是反转录病毒，含有标准的反转录病毒基因和几种其他非正常基因组，与许多其他反转录病毒不同，HIV会杀伤许多受感染细胞(主要是T淋巴细胞)而引起肿瘤。这样逐渐导致宿主机体免疫系统的抑制。HIV的反转录酶的错误率比其他已知的反转录酶高10倍或更多，致使该病毒有更高的突变率，病毒基因组复制时，每次通常有一个或几个误差，因此，任何两个病毒RNA分子几乎总是不同的。人类免疫缺陷病毒HIV基因组：除含有特殊的反转录病毒基因组之外，还包含具有多种功能(未鉴定的和未知的)的几个小基因，有些基因发生重叠。选择性剪接机制使其小的基因组可表达产生很多不同的蛋白质。三、DNA的修复错配修复碱基切除修复核苷酸切除修复直接修复遗传重组修复甲基化在错配修复中的识别作用甲基引导错配修复的起始过程示意图甲基引导的错配修复的完成DNA的碱基切除修复途径(d)DNA聚合酶I留下的切口由DNA连接酶封闭。(a)DNA糖基化酶识别损伤的碱基，在主链的碱基和脱氧核糖之间断裂。(b)AP内切核酸酶断裂AP位点附近的磷酸二酯键。(c)DNA聚合酶I从切口的游离3′-OH启动修复合成，除去部分损伤链(由5′→3′外切酶活性起作用)，以未损伤DNA链取代。大肠杆菌和人类的核苷酸切除修复(a)核苷酸切除酶在庞大的损伤部位与DNA结合；(b)核苷酸切除酶切除损伤的DNA链的任意一侧，DNA片段在解旋酶的帮助下去除；(c)缺口由DNA聚合酶填补；(d)留下的切口由DNA连接酶封闭光解酶修复嘧啶二聚体DNA损伤引起突变的实例O-甲基鸟嘌呤的直接修复：甲基转移酶DNA重组同源遗传重组(homologousgeneticrecombi-nation;也称普通重组)位点特异性重组(site-specificrecombination)DNA转座(DNAtransposition)真核生殖系细胞的减数分