选修1专题5课题3-血红蛋白的提取和分离课件

高中生物技术实践课件血红蛋白的提取和分离

本课题学习目标

体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法

4、课题难点：①样品的预处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息

蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究蛋白质的研究首先要获得纯度较高的蛋白质，怎样提取，分离蛋白质呢？课题背景：血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.提问：血液有哪些成分？1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白课题背景：血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：课题背景：1.分离生物大分子的基本思路：

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

一、血红蛋白的提取和分离（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。

根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。1.概念：（一）凝胶色谱法（分配色谱法）3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应：

①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程

（二）缓冲溶液

1.概念:

在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。

能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:

（二）缓冲溶液3.缓冲溶液的配制:

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:

利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液

缓冲溶液的组成及分类①弱酸及其对应的强碱盐：②弱碱及其对应的盐：③多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:H2CO3→NaHCO3；CH3COOH→CH3COONaNH3•H2O→NH4CL;NH4OH→NH4CLNaHCO3→Na2CO3

；NaH2PO4→Na2HPO4

缓冲溶液由缓冲对、缓冲剂或缓冲系组成。常见的缓冲对主要有如下三种类型：

（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

（三）电泳：1.概念：2.原理：3.类型:琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，即分子所带电荷决定运动方向琼脂糖凝胶电泳：1、什么决定了电泳中分子移动的方向？2、分子迁移速度由什么决定？分子带电性质，分子大小和形状

聚丙稀酰胺凝胶电泳1、在测定蛋白质分子量时常用SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳。SDS：十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶：丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。图P5—16

聚丙稀酰胺凝胶电泳

引发剂和催化剂

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS的作用：消除净电荷对迁移率的影响2.原理：

聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别：聚丙烯酰胺凝胶电泳：不加SDS，决定迁移速率的因素是电荷多少和分子大小SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳：加入SDS，决定迁移速率的因素是分子大小

聚丙稀酰胺凝胶电泳

SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS作用机理:

二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定不同蛋白质的分离有很大差别，本实验实验材料是哺乳动物的血红蛋白（一）蛋白质提取和分离步骤

二、实验操作1.样品处理：（二）操作过程

本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。处理过程：红细胞洗涤，血红蛋白释放，分离血红蛋白溶液，透析(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的:

去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。

二、实验操作(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的:②洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。1.样品处理：采集得到鸡血柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果(2)血红蛋白的释放：

加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

二、实验操作磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次(4)透析：

①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

二、实验操作透析过程动画演示利用透析袋透析2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：

（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装配好的凝胶柱

④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

（2）凝胶色谱柱的装填50cm高（3）样品加入与洗脱

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。

1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？

2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？

血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考下面的问题：3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：

①丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺:

用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。②十二烷基硫酸钠（SDS）:

用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。④TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。⑤用去离子水配制10%过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦样品处理液：

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。⑧染色液：

0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。⑨脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。

1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。

2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。

3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

①SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。②分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备：3、电泳方法步骤（3）样品处理：在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100℃温度下加热3min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按顺序加样，加样量通常为10—25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2h。