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文档简介

植物基因工程Bt抗虫基因载体构建

一、流程二、Bt基因简介三、Bt基因的合成四、Ti质粒简介五、Ti质粒改造（酶切、连接和检验）一、Bt抗虫基因载体构建流程

NCBI查询获取Bt基因序列

以Bt基因为模板设计引物Bt抗虫基因的合成PCR、切胶回收

DH5α、PMD—18克隆

LB、Amp筛选

Bt基因

酶切连接检验

Ti质粒二、Bt基因简介Bt基因即是苏云金芽胞杆菌基因。苏云金芽胞杆菌在外界条件苛刻或营养体老熟时，将进入产胞循环，包裹在芽胞与晶体外侧的细菌壁在后期破裂，释放出自由的芽胞和伴胞晶体；伴胞晶体对鳞翅目和鞘翅目昆虫（比如小菜蛾）有很强的杀伤作用。三、Bt基因的合成通过NCBI数据库获得Bt基因序列，并以此为模板设计引物。引物的设计通过软件primer5来完成。引物设计的一般原则

序列选取应在基因的保守区段。避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构。引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高）四、Ti质粒简介五、Ti质粒改造酶切连接检验5.1酶切野生型的Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，为了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体，必须切除T-DNA上的Onc基因。5.1酶切切除T—DNA上的致瘤基因，仅保留两侧边界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。5.2酶切位点的处理用相同的限制内切酶切割Bt基因所在片段和Ti质粒，使目的基因和Ti质粒产生的缺口能够互补而获得酶切序列。设计目的基因引物时酶切位点及保护碱基。5.3链接

在连接酶作用下目的基因与大肠杆菌质粒进行连接

培养连接后将TI质粒转入大肠杆菌中，并在LB+Amp培养基内培养。选择出转化成功的农杆菌继续培养。5.4检验

一、酶切检验：用上一步中所用的限制内切酶切割质粒，切割下来的片段测序，看是否是目的基因。二、PCR检验：通过PCR扩增出大量序列，与Marker比较鉴别是否是目的基因。目的基因转入农杆菌中大肠

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