第四章氧的传递与供需

第四章氧的传递与供需氧是一种难溶于水的气体，在25℃，1×105Pa条件下，氧在纯水中的溶解度仅为1.26mmol/L，空气中的氧在纯水中的溶解度更低（0.25mmol/L）。培养基因含有大量的有机和无机物质，氧的溶解度比水中还要低。这就决定了大多数微生物深层培养需要适当的通风条件，才能维持一定的生产水平。4.1细胞对氧的需求比耗氧速率（）:单位质量的细胞（干重）在单位时间内消耗氧的量，（也称呼吸强度）。当氧是限制性基质时，比耗氧速率4.1细胞对氧的需求摄氧率(OUR

)：单位体积培养液在单位时间内消耗氧的量。摄氧率与比耗氧速率有以下关系:临界溶氧浓度：当氧为限制性基质时，维持细胞正常生长繁殖的最低氧浓度称为临界溶氧浓度。微生物的临界氧浓度大约是饱和浓度的1％-25％。氧在培养液中的溶解度很低，但在培养过程中不需要使溶氧浓度达到或接近饱和值，而只要超过某一临界氧浓度即可。细胞生长对比耗氧速率的影响在分批培养过程中，在对数生长初期，比耗氧速率达最大值。但此时细胞浓度尚很低，摄氧率并不高，随着细胞浓度的迅速增高，培养液的摄氧率也迅速增高，在对数生长期的后期达到峰值。对数生长阶段结束，比耗氧速率下降，虽然此时细胞浓度仍有增加但培养液的摄氧率下降。最后因基质耗尽，细胞自溶，摄氧率便迅速下降。碳源种类对细胞比耗氧速率的影响

一般微生物细胞利用葡萄糖的速度比其它糖快，因而在含葡萄糖的培养基中表现出较高的比耗氧速率。在分批培养过程中，随着碳源的消耗，成为限制性基质，细胞的呼吸强度下降。补入碳源后，培养液的摄氧率往往有明显增加。此外，培养条件（如pH，温度等）对细胞的需氧要求也有影响；一些有害代谢产物的积累，也会抑制细胞的呼吸强度。其他影响因素氧的满足度

通常溶解氧浓度对细胞生长和产物生成的影响可能是不同的，即对于细胞生长的最佳溶氧浓度不一定是生成产物的最佳氧浓度。溶解氧浓度与临界氧浓度之比称为氧的满足度。氧的满足度对于谷氨酸和天门冬氨酸类氨基酸的生产，当溶解氧浓度低于临界氧浓度时，氨基酸的产量下降，但对于苯丙氨酸，缬氨酸和亮氨酸的生产，则在低于临界氧浓度时获得最大生产能力，它们的最佳氧浓度分别为临界氧浓度的0.55、0.60、0.85倍。问题？：请你利用生物化学的知识解释上述现象的原理？4.2培养过程中氧的传递氧从空气泡传递到细胞的过程中需要克服的阻力：1）从气相主体到气液界面的气膜传递阻力1／Ka2）气液界面的传递阻力1／Ki3）从气液界面通过液膜的传递阻力1／KL4）液相主体的传递阻力1／KLB5）细胞或细胞团表面的传递阻力1／KLC6）固液界面的传递阻力1／KIS7）细胞团内的传递阻力1／KA8）细胞壁的阻力1／KW9）反应阻力1／KR在以上的这些阻力中：1）－4）项是供氧方面的氧传递阻力；5）－9）项是耗氧方面的阻力，而氧从空气泡到细胞的总传递阻力为上述各项传递阻力的总和。这种传递阻力有主次之分。当细胞以游离状态存在于液体中时，阻力7）细胞团内的传递阻力消失，而当细胞吸附在气液界面上时，阻力4）5）6）7）消失。培养过程中氧的传质理论基础氧在克服上述阻力进行传递的过程中需要推动力，传递中的总推动力就是气相与细胞内的氧分压之差，这一总推动力消耗于从气相到细胞内的各项串联的传递阻力。当氧的传递达到稳态时，总的传递速率与串联的各步传递速率相等。这时通过单位面积的传递速率为：4.2.1

气－液相间的氧传递

氧从气相传递到液相是气液相间氧的传递过程，在此传递过程中气液界面的阻力1／KI可以忽略。1／KLB很小也可以忽略，此时主要的传递阻力存在于气膜和液膜中。双膜理论的基本假设假定在气泡和包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的气泡一侧存在着一层气膜，在界面的液体一侧存在着一层液膜。气膜中的气体分子与液膜中的液体分子都处于层流状态，分子之间无对流运动，因此氧的分子只能以扩散方式，即借助于浓度差而透过双膜。气泡内除气膜以外的气体分子处于对流状态，称为气流主体，在空气主流空间的任一点氧分子的浓度相同，液体主流中亦如此。根据双膜理论，氧分子是借助于扩散作用透过气膜，穿过界面进入液膜并形成溶液，然后再以扩散方式透过液膜到达液相主体，当气－液传递过程处于稳态时，通过液膜和气膜的氧传递速率相等即:氧传递速率计算

根据亨利定律：对于难溶气体（如氧），气膜传递阻力与液膜传递阻力相比可以忽略不计，即1／HkG<<1/kL，因此kL=KL在单位体积培养液中，氧的传递速率为：OTR－单位体积培养液中的氧传递速率mol/m3·s；－比表面积，m2/m3;通常将KL与合并在一起KLa作为一个参数处理，称为体积传递系数或容量传递系数（s-1）。4.2.2

液－固相间的氧传递稳态时，通过细胞或细胞团外液膜的传递速率OTR＝kLCaC(CL-CC)式中：

－液固比表面积m2/m3

Cc－细胞或细胞团表面氧浓度mol/m3假定细胞或细胞团为球形则有因为细胞密度和液体密度非常接近，相对运动速度ω很小，4.2.3

细胞团内的氧传递氧进入细胞团后，一方面向内部扩散，同时不断被细胞消耗，浓度不断降低。为简化起见，我们将细胞团看作一个消耗氧的均匀体，设其半径为R，密度为ρ，取其半径为r处一层厚度为dr的球壳进行物料衡算。4.2.4氧传递速率与细胞呼吸关系培养液中的溶解氧浓度对好氧培养过程有很大的影响，而溶解氧浓度却依赖于氧传递和被利用的相对速率，氧从气相到液相的传递过程中，气膜对于氧传递的阻力来说可以忽略不计，氧传递主要是由液膜的传递阻力来决定，平衡时氧传递速率与细胞呼吸强度之间的关系可由下式表述：4.2.5氧传递系数的关联在通气搅拌反应器中，氧传递系数很大程度上取决于细胞的大小和气泡附近的流体力学性质。因为氧传递的主要阻力是气泡周围的液膜阻力，所以氧的扩散是影响质量传递系数的主要因素。液相氧传递系数随气泡大小变化，当气泡直径dp<2.5mm时，KLa正比于扩散系数的1/2次方，一般区别大气泡和小气泡的临界直径为2.5mm。4.3培养基的流变特性培养基的流变特性直接影响动量、热量和质量的有效传递继而影响到各种发酵条件，如溶氧速率、气体交换、发酵温度、营养物的补充、pH值的调节等。所以有必要了解培养液的流变特性。牛顿流体在两块相互靠近的平行板之间充满流体，下板固定不动，给上板施加一作用力F，使上板以一定的速度运动。其中与上板接触的流体层以与上板相同的速度一起运动，与下板接触的流体则保持静止，中间各层因流体的内摩擦产生速度不等的平行运动，在流体层中产生速度梯度。当剪应力（单位流体面积上的切向力F/A）与速度梯度成正比时，可以用牛顿粘性定律来表示：牛顿流体牛顿型流体服从牛顿粘性定律，其主要特征就是粘度只是温度的函数，与流变状态无关，因此是一常数（如气体、低分子的液体或溶液）。这意味着发酵罐中搅拌转速的快慢对粘度没有影响，并且在同一搅拌转速下，在发酵罐的全部培养液中的任何局部的粘度相同。非牛顿型流体非牛顿型流体不服从牛顿粘性定律，其粘度不是常数，它不仅是温度的函数，而且随流动状态而异，因此没有固定的粘度值。根据非牛顿型流体的剪应力与切变率之间的关系，可分为：拟塑性流体、平汉塑性流体、涨塑性流体、凯松流体。非牛顿型流体拟塑性流体这种流体的主要特征是其粘度随着剪切速率的增高而降低。因此在同一流体中，不同搅拌转速下，所显示的粘度不一样；在同一搅拌转速下，培养液中的剪切速率随着离开搅拌涡轮的径向距离，按指数倍数降低，所以离开涡轮的径向距离越远，粘度越高。拟塑性流体可表示为：非牛顿型流体平汉塑性流体主要特征是当剪应力小于屈服应力时，液体不发生流动，只有当剪应力超过屈服应力时才发生流动。它的流变曲线是不通过原点的直线，其流变特性可用下式表示：屈服应力：对应于变形过程某一瞬时进行塑性流动所需的真实应力叫做该瞬时的屈服应力非牛顿型流体涨塑性流体主要特征是其粘度随着剪应力的增高而增高，与拟塑性流体相似，它的流变特征也具有指数规律n的数值越大，非牛顿特性就越显著。链霉素、四环素和庆大霉素的前期发酵液及很稀的酵母悬浮液呈现涨塑性。非牛顿型流体凯松流体流动模型为有研究表明青霉素发酵液为凯松流体。非牛顿型流体非牛顿型流体没有确定的粘度值，通常把一定切变率下剪应力与此切变率之比称为表观粘度，即4.4

溶解氧的测定方法化学法极谱法复膜氧电极法压力法化学法在样品中加入硫酸锰和碘化钾碱性溶液生成氢氧化锰，氢氧化锰和溶解氧反应生成锰酸，在上述反应液中加入硫酸使生成的锰酸盐与碘化钾反应，释放出游离的碘，再用硫代硫酸钠标准溶液进行滴定。从而计算出溶解氧。化学法的优缺点优点：测定比较准确，能直接得到氧的浓度，是其它测定方法的基础。也常用于衡量其它方法的准确性。缺点：但是如果样品带有颜色时，这些颜色会干扰测定的终点的判断。除此之外，样品中如果有一些氧化还原性物质存在，也会影响测定的准确性。因此化学法不适用于直接测定发酵液中溶解氧的浓度。极谱法基于溶解氧在一定的条件下会被还原成双氧水的反应：给浸在待测样品中的金属阴极和阳极加直流电压，当电压固定在0.8V左右时，与阴极接触的液体中的溶解氧发生上述反应而被消耗，阴极表面与液体的主体间就产生一个浓度差，于是液体主体的溶解氧就会扩散到阴极的表面参与电极上的反应，电路中能维持一定的电流。当样品的氧扩散过程达到稳定状态时，可测得回路中的扩散电流，并按下式计算：由于电极反应速度很快，实际上阴极表面的氧浓度Cc可视为零。因此有式：由此可见，溶解氧的浓度与测得的扩散电流成正比，根据对一系列已知氧浓度的样品的电流测定将获得的电流值对氧浓度作图就可以得到标准曲线。同化学法一样，如果样品中含有其它的还原性的物质也会影响电极的反应。从而影响到该法的准确性，使测定结果有误差。复膜氧电极法复膜氧电极的阴极材料为铂或银，阳极材料为铅，电解质一般为氢氧化钾或醋酸缓冲液。极谱型复膜氧电极在使用时需外界加给一定的电压才能工作；原电池型复膜氧电极在使用时不需要外界再施加电压。其电极反应为：复膜氧电极所测得的实际上是氧从液相主体扩散到阴极的扩散速率。氧从液相主体到达阴极表面地推动力是氧的分压，氧从被测的介质经过电极膜外侧的滞留液膜、电极膜和电解质才扩散到阴极表面，当氧的扩散过程达到稳定状态时，单位面积氧的扩散速率为：如果所用复膜氧电极的阴极面积为A，原电池氧电极的稳定电流为：由上面公式可知，复膜氧电极测定的是氧的分压。压力法恒温的密闭容器中装入体积为VL的样品液，液面恰好位于容器中的玻璃板处。抽真空除液体中的溶解气体，然后补充经脱气的溶剂，使液体体积恢复到VL，从储气袋向容器通入氧气，此时系统中氧压力为P1，开始搅拌使液体不断从玻璃板上翻动，进行气体的吸收，直到气液达到平衡测定此时的氧压力为P2，如果容器中氧气的体积为VG，那么就可求出氧在样品中的溶解度：4.5氧传递系数的测定亚硫酸盐氧化法该法在反应器中加入亚硫酸钠溶液，进行通气搅拌，使亚硫酸钠与溶解氧生成硫酸钠。由于亚硫酸盐的氧化速率远高于氧的溶解速率，使上述反应速度由气液相的氧传递速度控制。通过用碘量法测定亚硫酸钠的消耗速率，便可根据亚硫酸钠的氧化量来求出氧的传递速率V。因为反应进行得很快，液相中氧的浓度为零就可得：计算时，常采用罐压P作为推动力，同时由于溶液中氧的分压为零，上式可写成：V=KGaP优点:

氧溶解速度和亚硫酸盐的浓度无关，且反应速度快，不需特殊仪器。缺点：亚硫酸盐对微生物的生长有影响，测定不能在真实的培养状态下进行，因此测得的数据不能完全反映真实培养状态下的溶氧情况，且仅能表示培养设备的通气效率的优劣。物料衡算法对培养液中的氧进行物料衡算：当培养过程中氧的传递处于稳态时:物料衡算法摄氧率r可由进气和排气中氧的分压变化而获得，对于理想混合的反应器，C*为与进气中氧分压平衡的氧浓度，因此如果已知氧在培养液中的溶解特性，测定进气氧分压和液相氧浓度，就可求出KLa。动态法

当停止向培养液中通气时，从培养液中溶氧浓度变化速率可以求出摄氧率，待培养液中的溶解氧浓度下降到一定程度时，（不低于临界溶氧浓度），恢复通气，则培养液中溶解氧浓度逐渐升高，最后可恢复到原来的水平。动态法排气法

排气法是一种在非培养状态下进行的测定氧传递系数方法。对于非培养系统，在被测定的培养设备中先用氮气赶去液体中的溶解氧或装入已除去溶解氧的0.1mol/L的KCl溶液，然后再通入空气并进行搅拌，定时取样用极谱仪或其它溶解氧测定仪测出溶解氧的浓度，记录溶液中的溶解氧浓度随时间的变化情况，由于这时的摄氧率r=0，对氧的物料衡算就可能化为：排气法4.6影响氧传递速率主要因素操作变量（温度、压力、通风量和转速）发酵液的理化性质（粘度、表面张力、氧的溶解度、发酵液组成及流动状态、发酵类型）反应器结构操作变量—搅拌搅拌搅拌器的形式，直径，大小，转速，组数搅拌器间距及在罐内的相对位置等对氧的传递速率都有影响。采用机械搅拌是提高溶氧传递系数行之有效的方法。它能从以下几个方面改善溶氧速率1）搅拌能把大的空气气泡打碎成微小的气泡，增加了氧与液体的接触面积。2）搅拌使液体作涡流运动，使气泡不是直线上升而是作螺旋运动上升，延长了气泡的运动路线，增加了气液的接触时间。3）搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少气泡周围液膜的厚度，减少液膜阻力，增大了KLa。4）搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递中接触面积的增加，使推动力均一，同时也减少了菌体表面液膜的厚度有利于氧的传递。操作变量—温度、压力温度和压力温度升高降低了发酵液的粘度与液体的表面张力，增大了氧在液相中的扩散系数，有利于提高溶氧速率。罐压高低和液柱高低的不同，都会影响氧溶解速率。通用式发酵罐中，通气量恒定，溶氧速率随压力的增加而增加，同时，KLa值也随压力增加而增大。操作变量—通风量空气的线速度氧传递系数Kla是随空气量的增加而增大的，当增加通风量时，空气的线速度也相应地增大，从而增加了溶氧，氧传递系数Kla也相应增大，当然过大的空气线速度会使搅拌桨叶不能打散空气，气流形成大气泡在轴的周围逸出，使搅拌效率和溶氧速度大大降低。反应器结构搅拌器空气分布管空气分布管的形式，喷口直径及管口与罐底距离的相对位置对氧溶解速率有较大的影响。当通气量较小时，喷口的直径越小，气泡的直径也就越小，氧传递系数也就越大，而当通气量超过一定值后，气泡的直径与通气量有关，与喷口直径无关。思考题牛顿性流体与非牛顿性流体的区别？拟塑性流体和涨塑性流体的特征是什么？溶解氧的测定方法有哪些？氧传递系数的测定方法有哪些？其中哪种方法能测定真实培养状态下的传递系数？培养液性质影响在发酵过程中，由于微生物的代谢活动，分解并利用培养液中的基质，大量繁殖，积累代谢产物等都引起培养液性质的改变，特别是粘度，表面张力，离子强度，扩散系数等，从而影响到气泡的大小，气泡的稳定性，进而对Kla带来的很大影响。培养液性质影响表面活性剂：培养液中消泡用的油脂等具有亲水端和疏水端的表面活性物质分布在气液界面，增大了氧传递的阻力，降低了Kla。

培养液性质影响离子强度：在电解质溶液中生成的气泡比在水中小得多，因而有较大的比表面积，而且随电解质浓度的增加，Kla也有较大的增加。培养液性质影响菌体浓度：发酵液中随菌体浓度上升，KLa下降。4.7控制溶氧的工艺控制溶氧的工艺主要从供氧和耗氧两个方面来考虑：供氧方面：通气流量（通风量）、搅拌转速、气体中的氧分压、罐压、温度、培养基的物理性质