第14章核酸的物化性质

第14章核酸的物理化学性质一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交一、核酸的水解（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键

嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键脱嘌呤：

pH1.6，37℃，对水透析

pH2.8，100℃，1h脱嘧啶：

98-100%甲酸，175℃，2h

三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或

80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的碱基组成2（二）碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感室温，0.3～1mol/LKOH，18-24h，可将RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。DNA抗碱水解生理意义：DNA更稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。3（三）酶水解非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶N-糖苷酶4核酸酶的分类底物专一性：核糖核酸酶RNase脱氧核糖核酸酶DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶(endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸二酯键的断裂方式：5′-（寡）核苷酸3′-（寡）核苷酸

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核酸酶（nuclease）ATCGTCCCGGTAGA化学本质是蛋白质5′3′外切酶内切酶限制性核酸内切酶具有序列特异性的核酸酶称为限制性核酸内切酶6二、核酸的酸碱性质磷酸和碱基均能发生两性解离。DNA等电点4～4.5RNA等电点2～2.5两性电解质：酸性的磷酸基和碱性的碱基

电泳和离子交换分离纯化核酸7三、核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外波段有强烈的光吸收。λmax=260nm8鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。含量计算1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA

或：40ug/mL单链DNA（或RNA）

或：20ug/mL寡核苷酸判断DNA是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）9四、核酸的变性、复性及杂交(一)变性(denaturation)核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。102202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值123变性因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）

变性后的理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。11DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度（meltingtemperature,Tm）。12影响DNA的Tm值的因素①DNA均一性均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。②G-C含量与Tm值成正比测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.4413③介质中离子强度

离子强度高，Tm高。14（二）复性(renaturation)

变性的DNA在适当的条件下，两条彼此分开的DNA单链重新缔合成为双螺旋结构的过程。15（三）核酸分子杂交(Hybridization)16不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）。制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。175’3’5’3’5’3’5’3’提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳、碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA杂交放射自显影Southernblotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。Southern印迹法

19NorthernBlotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）。WesternBlotting抗原与抗体的杂交研究对象是蛋白质，“探针”是抗体。20基因芯片21小结

核酸