(上课用)高效液相-(2011年3月)10-11-6

第十三章高效液相色谱法第一节概述

高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、高效液相色谱仪流程图四、特点一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段

柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测2．HPLC：分离和分析

柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%续前2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置续前四、HPLC的特点和应用

“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）第二节基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论——平衡理论基础动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论二、速率理论三、HPLC法中分离条件的选择一、塔板理论二、速率理论（与GC对比）

1.续前1）涡流扩散项及其影响next2.讨论：

续前2）传质阻抗项及其影响

越大,流动相传质阻力越大,因为组分接近两相界面的阻力增大.比如:湍急的河水把小船送到离既定目标更远的地方.图示3）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）图示back三、HPLC法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：

选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min

3.柱温的选择：

选室温250C左右第三节各类高效液相色谱法

一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）一、液固吸附色谱法（LSC）

流动相为液体，固定相为固体吸附剂

1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等续前2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108

堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想

原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物续前3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂

例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液二、液液分配色谱法（LLC）1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失

固定液——极性→NLLC固定液——非极性→RLLC3．正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱

适于分离极性组分反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分三、化学键合相色谱法（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（三）正相键合相色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱(bondedphasechromatography,BPC)（一）化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：1）不易流失2）热稳定性好3）化学性能好4）载样量大5）适于梯度洗脱（二）反相键合相色谱1．分离机制：疏溶剂理论:非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂接触时,产生斥力,使溶质分子中的非极性基取向,导致在溶剂中形成”空腔”,这种效应称为疏溶剂效应或疏水效应.由于溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力,促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合,且缔合反应是可逆的.续前2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱(十八烷基硅烷键合相,octadecylsilyl,ODS柱——HPLC约80%问题）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）

例：水+甲醇，乙腈，THF(四氢呋喃)4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑P534表20-5，反相洗脱溶剂的强度因子（水-0，甲醇-3.0，乙腈-3.2），有机溶剂量增加，流动相的溶剂强度增加，洗脱能力增强，组分的k降低5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）7.必须注意烃类键合相适用的pH范围为2-8pH>8.0破坏键合相与载体的结合pH<2.0腐蚀柱子（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇续前4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等（四）离子对色谱和离子抑制色谱1．反相离子对色谱法2．反相离子抑制色谱1．反相离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：P522烷基磺酸钠→分析阳离子和碱类（平衡离子选阴离子）四丁基季胺盐→分析阴离子和酸类（平衡离子选阳离子）2）影响k的因素a．与m的极性有关（同反相色谱）b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑3）适用：较强的有机酸、碱2．反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值酸性物质——加入酸HActR↑，k↑碱性物质——加入碱NH3·H2OtR↑，k↑调节pH范围：3.0~8.0

pH>8.0破坏键合相与载体的结合pH<3.0腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物第四节影响分离的因素1．续前2．对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气(超声波脱气）续前

3．洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）图示第五节高效液相色谱仪1．泵：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用2．进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀输液泵→进样器→色谱柱→检测器→记录输液泵：——往复泵

缺点:脉动双泵补偿:克服脉动(并联,串)(P536)六通进样阀(P537)续前3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗装柱是一项技巧性很强的技术，它直接影响柱效。当填料>20μm，较易装，干法，轻叩。粒度<20μm，匀浆装柱。（先将填料用等密度的有机溶剂匀浆，再高压装柱。无论装柱还是买柱，要进行柱效检查。测度条件根据柱类型不同而选用不同的检测。测出各组分的W，tR，求出n和R≥1.54．检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质可变波长型max光电二极管阵列型2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）蒸发光散射检测器4）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格5）电化学检测器第七节定性、定量分析一、定性分析：

1、tR:γ12——相对保留值=

2、化学鉴定：对HPLC流出组分收集，用专属性化学反应对收集的分离物质组分进行定性。

3、联机技术：HPLC—MS、HPLC—FTIR

质谱缚立叶转换红外光谱二、定量分析：与气相色谱同。

1、外标法：以试样的标准品作对照物质，相对比较求含量。（1）工作曲线法：用待测组分的标准品配制一系列浓度不同的标准溶液(Ci)s，准确进样，测量峰面积(Ai)s或峰高(hi)s，与(Ci)s绘制工作曲线，利用此曲线或它的回归方程，计算样品溶液的含量。（2）外标一点法：（与气相同）

mi=2、内标法：内标选择同气相。（1）工作曲线法：在待标准溶液系列中，同体积加入相同量的内标物、进样，分别测出标准物与内标物的A或h，以Ai/As~(Ci)s作图。（2）内标一点法：在药物分析中，校正因子常常不知，则先配已知浓度标准品，加入一定内标，再将内标按同量加入同体积样品中，分别进样。（Ci%）样品=(3)、校正因子法：第一步：精称被