混合菌的分离

混合菌的分离实验目的1.掌握常用的分离纯化微生物的方法。2.学习倒平板的方法，进一步掌握无菌操作技术。实验原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。本实验将采用不同的培养基，通过稀释涂布平板法和平板划线法，从混合菌液中分离微生物。涂布平板法：做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。平板划线法：是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。具体的划线形式有多种，这里介绍一种经过我们长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌群收获区，它的面积最大，出现单菌群的概率也最高。由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。实验器材实验材料:混合菌夜（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌）牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏一号培养基试剂链霉素、工业酒精实验仪器:试管、涂布器、0.1-0.2ml无菌吸管、接种环，酒精灯、无菌培养皿、试管架、培养箱、超净工作台、记号笔、废液缸1.配制牛肉膏蛋白胨培养基和马丁氏培养基配方：*牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml）牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.0-7.2(后调)*马丁氏培养基（1000ml）蛋白胨0.5g，葡萄糖10.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH自然*高氏一号培养基（1000ml）可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6注意：高氏一号培养基配制时要将可溶性淀粉用蒸馏水调成混悬液然后在加入到热水中，配制成淀粉浆，然后在加入其它的药品。（1）根据实验中培养基用量计算培养中各药品的用量，每实验台（4个小组）共同配制牛肉膏蛋白胨培养基400ml、马丁氏培养基400ml、高氏一号培养基400ml（2）需要准备一下物品：锥形瓶500ml3支（盛装培养基，每大组）试管3支（小组，装有蒸馏水一支9ml，另两支4.5ml，塞好棉塞包扎）移液管1ml3支（小组）培养皿9套（小组）吸耳球1支（小组）

2.加热、包扎、灭菌a.将培养基根据要求调pH值，牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基pH7.0－7.2；马丁氏培养基pH自然，加琼脂进行加热溶解，煮制澄清时停止加热，每小组各分装牛肉膏蛋白胨培养基2支，塞好棉塞，备用。b.包扎将锥形瓶3支、培养皿9套、盛装蒸馏水的试管3支、装有培养基的试管2支、移液管3支、吸耳球1支分别按照要求使用报纸包扎好，备用。c.灭菌将准备好的物品放入灭菌锅中进行灭菌，121℃，25mind.倒平板将灭菌后的培养基冷却55℃左右时，进行分装。每种培养基分装倒3个平板。在倒培养基之前将培养皿底部做好标记，然后无菌操作倒培养基。培养基的厚度约为培养皿整个高度的1/3。让培养基充分凝固，备用。注：灭菌物品取出之后立即将装有培养基的试管摆好斜面。斜靠在玻璃棒或书本等合适的支撑物上，形成斜面，斜面长度不超过试管总长的1/2，备用。

3.混合菌夜稀释液的制备：取混合菌夜1ml，加入盛有9ml无菌水的试管中，稀释浓度为10-1，从浓度为10-1试管中取0.5ml稀释液加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，分别制成稀释度为10-2～10-3的稀释液。4.涂布平板法：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度中即10-1、10-3试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。5.平板划线法a.作分区标记在皿底将整个平板分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120度左右（平板转动一定角度约60度），一遍充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区和A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。b.划线操作（1）用接种环挑取10-1少量混合菌夜；（2）划A区，划3-4条平行线（线条的多少依据挑取的菌量多少而定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在接种时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方（不要放入皿盖内），以防止杂菌污染。（3）划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但话D区时切勿重新接触A、B区，以免该两区中浓度的菌夜带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的菌线。6.培养：马丁氏倒置培养于28℃培养箱中培养3-5d，牛肉膏蛋白胨培养基在37℃培养1-2d。实验结果1.平板划线法中检查每个平板分离的结果，绘制菌苔或菌落的分布图。2.涂布平板法中用下图描述菌落生长情况。培养物生长情况（+或-）染菌情况（+或-）牛肉膏10-1牛肉膏10-3马丁氏10-1马丁氏10-3注意事项1.药品称量要符合称量规则2.调pH值，应小心操作，避免过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度3.加热过程中要不断搅拌，控制火力，防止培养基因暴沸而溢出或琼脂沉淀在瓶底烧