从生物样品中分离纯化生物大分子

医学生物学

设计探索实验从生物样品中分离纯化生物大分子从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶2从生物样品中分离纯化生物大分子3生物大分子

生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。

生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，例如蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸等从生物样品中分离纯化生物大分子——背景知识根据不同生物大分子的特性制定不同的实验条件4生物大分子分离纯化的特殊性从生物样品中分离纯化生物大分子——背景知识⑴生物材料的组成极其复杂，有数百种至几千种化合物。⑵生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑶生物大分子离开了生物体内的环境极易失活，因此如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。

生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。5前期准备细胞破碎分离纯化提取鉴定浓缩、干燥、保存从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线6从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线1.确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求2.建立相应可靠的分析测定方法3.查阅文献调研和预备性实验前期准备7前期准备细胞破碎分离纯化提取鉴定浓缩、干燥、保存从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线8细胞破碎机械破碎化学破碎物理破碎酶学破碎从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线9前期准备细胞破碎分离纯化提取鉴定浓缩、干燥、保存从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线1011分离纯化从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。11前期准备细胞破碎分离纯化提取鉴定浓缩、干燥、保存从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线12提取鉴定从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。物理、化学方法：比色法、气相/液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。但应注意，如果实验对精确性要求较高则必须同时采用2-3种不同的纯度鉴定法才能确定。生物学的测定法：酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；

实验需要了解的理化性质

在水和各种有机溶剂中的溶解性。在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。固态时和冻干时的稳定性。

物理性质：分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。

化学性质：对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力等。离子交换柱层析法电泳法电荷性质的差异分子大小形状差异凝胶过滤法超滤法透析法离心法溶解度差异分配层析萃取结晶盐析有机溶剂沉淀选择性沉淀沉淀法生物功能专一性亲和层析13前期准备细胞破碎分离纯化提取鉴定浓缩、干燥、保存从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线14浓缩、干燥、保存从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线浓缩：从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶液的过程。干燥：把潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。干粉保存：0-4℃冰箱中保存即可（样品置于干燥器中）。液态保存：0-4℃冰箱即可。不能放在0℃以下，因为结冰会使大分子构象破坏，使其失活。15比赛评委分离纯化细胞破碎提取鉴定前期准备浓缩、干燥、保存完成内容从生物样品中分离纯化生物大分子——技术路线16比赛评委从生物样品中分离纯化生物大分子——常见生物大分子分离纯化17分离纯化原则：

保持核酸分子一级结构的完整性

意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9);保持一定离子强度;减少物理因素对核酸的机械剪切力。

防止核酸生物降解

DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂

RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物

②分离纯化的步骤：

取材：核酸在细胞内部，所以需要破碎细胞才能取得核酸，常用方法如下：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等）核酸的分离纯化

除杂：

肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死；加入淀粉酶；在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA。

蛋白质的除去：加入去污剂如SDS；氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提；苯酚水溶液抽提；加入浓盐溶液如NaCl。

不同类型核酸的分离：（1）从DNA中除去RNA：核糖核酸酸酶选择地破坏RNA；钙盐分步沉淀；活性炭吸附。（2）从RNA中除去DNA：苯酚水溶液抽提；加入脱氧核糖核酸酶处理。

同类核酸的分离：（1）RNA混合物的分离：多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。（2）DNA混合物的分离：常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶，梯度离心等方法。

浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。常用方法如下：

盐溶液沉淀：如MgCl2；NaAc；KAc等。

有机溶剂沉淀：如乙醇；异丙醇；聚乙二醇（PEG）；精胺等。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。

测定：一般选用紫外分光光度法或溴乙锭荧光法测定核酸的含量。

保存：对DNA和RNA有不同的保存方式：

对DNA：DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。对RNA：RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存；长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2mol/L氧钒核糖核苷复合物冻贮于-70℃,可保存数年。比赛评委从生物样品中分离纯化生物大分子——常见生物大分子分离纯化18脂质的分离纯化

注意：组织破碎的方法会影响提取的脂质的浓度，因此分析的时候必须将各种破碎方法进行比较。

操作方法：按照Folchmethod法进行操作：

先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织按1：20的量和氯仿/甲醇一起组织均浆，分层后在室温下在摇床中摇动15-20分钟。均浆通过滤纸过滤或者离心获得液体。在离心获得的液体中加入0.2倍体积的水或者0.9%的生理盐水，涡旋几秒钟混均，然后2000rpm离心得到两相溶液，如果需要的话用甲醇/水（1/1）的将两相界面洗一到两次，洗的过程不要让甲醇/水与下层混合。通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相含有脂质，如果体积在2-3ml以下则通过真空旋转蒸发器或在氮气下浓缩。二氯甲烷可以替代氯仿，结果表明二氯甲烷/甲醇能够取代氯仿/甲醇，因此能够避免氯仿带来的健康、安全和管理问题。比赛评委从生物样品中分离纯化生物大分子——常见生物大分子分离纯化19

单、双糖：常见的单、双糖一般采用合成的方式。制备如下：脱脂→去杂→浓缩→再次去杂→脱色→浓缩→冷却→结晶（→进一步纯化）。

多糖的分离纯化：

脱脂：由于多糖被脂质包围，通常用醇或醚回流脱脂。

提取：

热水浸提法微波辅助提取法超声辅助法索氏提取法醇提法其它方法（如稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等）糖类的分离纯化

除杂：

除蛋白质：沙维积法（Sevag法）；三氟三氯乙烷法；三氯醋酸法；酶解法；盐酸法；其它方法（如加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白，但此方法不够彻底）。

除色素：活性炭除色素；弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素（针对植物色素）；氧化脱色（糖和色素时结合，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱的）；依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖；用4:1的氯仿-正丁醇除色素

除低聚糖等小分子杂质：逆向流水透析法。

纯化：分部沉淀法、盐析法、季铵盐沉淀法、制备性区域电泳膜分离法、金属络合物法其它方法（如超过滤法、活性炭柱色谱、LKB柱色谱系统等）

纯度鉴定：多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分.多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC法等.现在应用较多的是HLPC法，旋光度测定也是纯度测定的一种方法。

分子量的测定：多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作.常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC法、MALDI－TOF－MS法.

结构测定：多糖一级结构测定：多糖的一级结构分析，主要是分析组成多糖的单糖类型、数目、连接方式及苷建构型.常用化学法和仪器分析法。多糖高级结构测定：目前研究多糖的二级结构常用的手段是NMR技术。近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律已达到前所未有的深度和广度。比赛评委从生物样品中分离纯化生物大分子——常见生物大分子分离纯化20基本原理：一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。纯化蛋白质大分子涉及纯度和产率实际中两者不能兼得，视目的而取舍。蛋白质的分离纯化（2）前处理：

定义：把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。选择适当的方法，破碎组织和细胞：

动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理法破碎；

植物组织和细胞：使用石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理。

细菌细胞：常用方法有超声波振荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。如果蛋白质主要集中在某一亚细胞，例如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞浆等。用差速离心方法分离，收集亚细胞组分材料。如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合，必须用超声波或去污剂使膜结构解聚。（3）粗分级：

定义：选用一套适当方法，把蛋白质混合物提取液中，所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。

方法：盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。（4）细分级：

定义：样品的进一步提纯。

方法：

层析法：凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。

电泳法：包括区带电泳、等电聚焦等（5）进一步分离纯化

沉淀法：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同，将目的蛋白质大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。包括：盐析、有机溶剂沉淀、结晶、等电点沉淀、选择性沉淀等（6）浓缩：

减压加温蒸发浓缩空气流动蒸发浓缩冰冻法吸收法超滤法（7）干燥与保存：真空干燥：适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存干燥的制品一般比较稳定，在低温0－4度，其活性在数日甚至数年无明显变化。比赛评委从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶21实验流程取动物肝组织制作组织浆液肝酶的粗提取肝酶的纯化鉴定肝酶纯度比赛评委从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶22梯度离心选取新鲜的，饥饿24小时的动物的肝脏，生理盐水多次洗涤，低温保存。取动物肝组织取新鲜动物肝脏低温下剪碎，放进培养皿中，移入匀浆器中，过滤。离心管中加入5ml0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻覆在其上1600r/min离心10min上清液1沉淀10ml0.25M蔗糖混匀3500r/min离心10min上清液2沉淀混合取1ml6600r/min离心10min上清液3（即为酶体和微粒体）比赛评委从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶23肝酶的粗提取等电点沉淀法实验原理

利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。

但由于蛋白质在pI点附近一定范围的pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。选用适当的缓冲液（CH3COONH4，或NaH2PO3-Na2HPO3），调节pH＝６.２，将目的物以沉淀状态分离，再重新溶于适当的缓冲液，以供进一步纯化。实验步骤比赛评委从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶24肝酶的纯化离子交换柱层析混合物在经过固定相和流动相的过程中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于其中各组分间在理化性质上存在着差异，因此当它们经过上述相同重复过程时，各自的情况就会有所不同，从而使各物质得以分离。离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE—纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。实验原理①DEAE-纤维素处理为PH=6.3（HCl）②装柱与平衡（乙酸铵溶液）③