高三生物一轮复习课件【知识建构+精讲精练】基因工程的基本工具和基本操作程序

基因工程的基本工具和基本操作程序基因工程

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。（章首页）01基因工程(重组DNA技术/转基因技术)的概念理解操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达原理基因重组结果创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品分子运输车分子手术刀分子缝合针限制性内切核酸酶----“分子手术刀”主要来自原核生物数千种▲限制酶不是一种酶，而是一类酶。来源种类特点GAATTCCTTAAG能识别双链

DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。02结果产生黏性末端或平末端GAATTCCTTAAG限制性内切核酸酶----“分子手术刀”作用部位识别序列长度特定切点上的磷酸二酯键大多数是6个核苷酸序列磷酸二酯键02限制性内切核酸酶----“分子手术刀”EcoRⅠ中轴线粘性末端平末端SamⅠ02限制性内切核酸酶----“分子手术刀”注意①能被限制性酶特异性识别的切割位点一般都具有回文序列：即在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条反向读的碱基序列完全一致。②在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割，会产生4个末端。02DNA链接酶----“分子缝合针”将双链DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶从大肠杆菌中分离得到只能链接互补黏性末端从T4噬菌体中分离得到黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低。作用种类03DNA链接酶----“分子缝合针”E.coliDNA连接酶&T4DNA连接酶E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶磷酸二酯键作用部位★DNA连接酶没有识别特异性03DNA链接酶----“分子缝合针”★思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；DNA连接酶连接的是DNA片段。03DNA链接酶----“分子缝合针”名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链归纳总结几种相关酶的比较03基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒04基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”作用将目的基因转入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制通常是用质粒，噬菌体、动植物病毒也可以。种类04基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”便于插入（携带）目的基因☆真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。运载体需具备的条件①能在受体细胞中稳定保存并复制②有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞④对受体细胞无害、易分离04基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”载体上标记基因的标记原理普通培养基不含抗生素选择培养基50µg/ml四环素04DNA的粗提取与鉴定05一、实验原理①利用DNA、RNA、蛋白质和脂质在理化性质方面的差异进行提取和分离

DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2M的NaCl溶液中

DNA不溶于（冷）酒精，但某些蛋白质溶于酒精②在一定的温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色①研磨：10g香蕉果肉＋10mL研磨液，充分研磨。②过滤：双层尼龙纱布过滤。③离心：3000r/min离心2min，取上清液。④加冷酒精：入等体积冷酒精，静置3～5min，用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶活性Tris-HCl缓冲液稳定DNANaCl溶解DNA二、实验步骤DNA的粗提取与鉴定05二、实验步骤⑤鉴定：丝状物或沉淀物＋二苯胺试剂2mL混匀，95℃沸水浴加热10min，冷却后观察到蓝色（二苯胺试剂2mL不加DNA做对照）。从左至右：少量DNA、大量DNA、空白对照DNA的粗提取与鉴定06例1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（）注：Y为C或T，R为A或G。A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGCDNA的粗提取与鉴定06例2.第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是（）A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和

Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶C基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定07从生物材料获取目的基因基因工程的基本操作程序071.目的基因的筛选与获取生物材料DNARNA一定大小范围的DNAcDNA逆转录基因组文库cDNA文库基因文库获取目的基因PCR导入受体菌中保存限制酶酶切包括已知序列：人工合成①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。①人工合成目的基因②用PCR特异性地快速扩增目的基因NCBIGeneBankBLAST聚合酶链式反应（PCR）根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。基因工程的基本操作程序071.目的基因的筛选与获取▲引物:在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3′端之后才能开始连接脱氧核苷酸。是能与DNA母链互补配对的一小段短单链核酸序列.基因工程的基本操作程序071.目的基因的筛选与获取--PCR思考用PCR可以扩增mRNA吗？不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增单链RNA逆转录酶杂交双链DNA链RNA链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNAPCR扩增DNA模板Step1：加热至90℃以上使双链分开Step2:冷却至50℃左右使引物与DNA结合引物Step3:DNA合成+DNA聚合酶+dATP+dGTP+dCTP+dTTP第一轮的产物①变性90℃以上②复性③延伸冷却加热50℃左右引物模板结合72℃左右DNA从5’端到3’端延伸。72℃时，基因工程的基本操作程序071.目的基因的筛选与获取--PCR①变性②复性③延伸循环基因工程的基本操作程序071.目的基因的筛选与获取--PCR思考获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？三次才能得到目的基因如何对产物进行检测鉴定？思考如何对产物进行检测鉴定？琼脂糖凝胶电泳基因工程的基本操作程序071.目的基因的筛选与获取--PCR

DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。思考如何对产物进行检测鉴定？琼脂糖凝胶电泳凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。

DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。基因工程的基本操作程序071.目的基因的筛选与获取--PCR基因工程的基本操作程序072.基因表达载体的构建(核心工作)游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。解决办法？思考质粒细菌染色体植物染色体细胞核表达载体基因表达载体的作用：①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；②使目的基因能够表达和发挥作用。☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。基因工程的基本操作程序072.基因表达载体的构建(核心工作)基因工程的基本操作程序072.基因表达载体的构建(核心工作)思考限制酶的选择构建载体时，需要用同种限制酶切割载体和目的基因，以获得相同的黏性末端，便于两者顺利连接。但是由于被切割后的质粒本身也具备相同的黏性末端，所以会有一定概率的自身环化，你有办法解决这个问题吗？请提出自己的看法。基因工程的基本操作程序072.基因表达载体的构建(核心工作)基因工程的基本操作程序073.将目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射法Ca2+处理法（感受态细胞法）受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子基因工程的基本操作程序073.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。基因工程的基本操作程序073.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法122.将新鲜的从叶片上取下的圆形小叶与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；1.将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。基因工程的基本操作程序073.将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序074.目的基因的检测与鉴定分子水平检测目的基因DNA分子杂交检测mRNA检测表达的蛋白质分子杂交抗原—抗体杂交PCR反应PCR反应标记基因标记基因检测目的基因DNA分子杂交检测mRNA检测表达的蛋白质分子杂交抗原—抗体杂交基因工程的基本操作程序074.目的基因的检测与鉴定分子水平PCR检测普通培养基不含抗生素选择培养基50µg/ml四环素抗性鉴定基因工程的基本操作程序074.目的基因的检测与鉴定个体水平抗虫鉴定棉铃虫棉铃虫（死亡）基因工程的基本操作程序074.目的基因的检测与鉴定个体水平05PCR片段扩增及电泳鉴定例4.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是（）A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物