微生物的遗传和变异第三节

微生物的遗传和变异第三节第一页，共六十四页，2022年，8月28日第二节细菌基因转移的方式细菌的三种水平基因转移形式接合转导转化p.237第二页，共六十四页，2022年，8月28日接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体作为载体介导转化(transformation)：游离DNA分子+感受态细胞第三页，共六十四页，2022年，8月28日一细菌的接合作用(conjugation)接合作用：通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息转移和重组过程第四页，共六十四页，2022年，8月28日证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）第五页，共六十四页，2022年，8月28日2.机制接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5×107Da

，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛

不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛第六页，共六十四页，2022年，8月28日第七页，共六十四页，2022年，8月28日F因子的四种细胞形式a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。第八页，共六十四页，2022年，8月28日第九页，共六十四页，2022年，8月28日1）F+×F-杂交杂交的结果：供体细胞和受体细胞均成为F+细胞F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。第十页，共六十四页，2022年，8月28日第十一页，共六十四页，2022年，8月28日Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株（Highfrequencyofrecombination）。2）Hfr×F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是在发生转移时，由于F因子除先导区(leadingregion)以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，因此F因子的转移是先导区结合着染色体DNA向受体细胞转移的。由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。第十二页，共六十四页，2022年，8月28日染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。第十三页，共六十四页，2022年，8月28日3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。第十四页，共六十四页，2022年，8月28日二细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导第十五页，共六十四页，2022年，8月28日1普遍性转导（generalizedtransduction）噬菌体可以转导供体细菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！第十六页，共六十四页，2022年，8月28日沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）第十七页，共六十四页，2022年，8月28日普遍性转导过程第十八页，共六十四页，2022年，8月28日2局限性转导（specializedtransduction）把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的过程第十九页，共六十四页，2022年，8月28日温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的过程第二十页，共六十四页，2022年，8月28日温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。第二十一页，共六十四页，2022年，8月28日3局限性转导与普遍性转导的主要区别：a）普遍性转导是误包；局限性转导是误切。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性，包装的可能全部是宿主菌的基因。第二十二页，共六十四页，2022年，8月28日三细菌的遗传转化（genetictransformation）定义：游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的基因转移过程。第二十三页，共六十四页，2022年，8月28日1、转化1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行转化，需要二方面必要的条件：受体细胞处于感受态：最容易接受外源DNA的一种生理状态。转化因子：外源游离dsDNA分子第二十四页，共六十四页，2022年，8月28日

以革兰氏阳性的肺炎链球菌为材料，其转化过程大体是：1、双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合。2、在位点上的DNA发生酶促分解，形成平均分子量为（4~5)x106D的DNA片段。3、DNA双链中的一条单链逐步降解，同时，另一条单链逐步进入细胞。第二十五页，共六十四页，2022年，8月28日4、转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA所交换和取代，于是形成了杂种DNA区段。5、受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。第二十六页，共六十四页，2022年，8月28日转化全过程第二十七页，共六十四页，2022年，8月28日转化整合过程第二十八页，共六十四页，2022年，8月28日转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率低b）不需要活的DNA供体细胞；第二十九页，共六十四页，2022年，8月28日人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术,该过程与细菌自身的遗传控制无关.用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。第三十页，共六十四页，2022年，8月28日接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化(naturalgenetictransformation)：游离DNA分子+感受态细胞第三十一页，共六十四页，2022年，8月28日第三节基因克隆及重组DNA技术利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或DNA序列插入一个载体DNA分子上，导入宿主细胞内，使其扩增和表达。基因克隆第三十二页，共六十四页，2022年，8月28日是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程（geneticengineering）或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。第三十三页，共六十四页，2022年，8月28日微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着不可替代的作用！“微生物与基因工程”第三十四页，共六十四页，2022年，8月28日一、基因工程的基本过程1.基因分离：a）分别提取供体DNA和载体DNA2.体外重组b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和载体连接，成为重组载体。3.重组载体的传递与筛选用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子.4.在特定的宿主中表达,得到基因工程产品第三十五页，共六十四页，2022年，8月28日第三十六页，共六十四页，2022年，8月28日大肠杆菌生产胰岛素第三十七页，共六十四页，2022年，8月28日假单胞菌生产毒素蛋白第三十八页，共六十四页，2022年，8月28日二、基因工程的发展历史对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：DNA的特异切割DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）DNA的快速测序聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增）DNA合成技术DNA的定点诱变技术第三十九页，共六十四页，2022年，8月28日基因工程工具酶基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restritionenzyme）。在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。第四十页，共六十四页，2022年，8月28日

限制性内切酶I型：单一多功能(限制-修饰)的酶，不是特异性的切割，所以用处不大。III型：双功能的酶，特异性的切割，用处不大。

II型：分开的核酸内切酶和甲基化酶(EcoRI,MEcoRI)。特异性的切割，十分有用。识别序列通常由4-8个碱基对组成，具有回文结构。EcoRI:EscherichiacoliRY13,识别序列:GAATTCCTTAAGBamHI:BacillusamyloliquefaciensH,识别序列:GGATCCCCTAGG第四十一页，共六十四页，2022年，8月28日限制性内切酶的剪切方式第四十二页，共六十四页，2022年，8月28日常用限制性内切酶第四十三页，共六十四页，2022年，8月28日

酶连

DNA连接酶(1967,许多实验室同时发现)的发现和应用对于重组DNA技术的创立和发展也具有头等重要的意义。将两段DNA拼接起来的酶叫连接酶，目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：第一种：粘性末端连接；第二种：平端连接；第三种：先在DNA末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，再进行连接。

T4噬菌体DNA连接酶：它催化DNA的5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键（Weiss等，1968）第四十四页，共六十四页，2022年，8月28日转化重组质粒DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。感受态细胞的转化电穿孔转化第四十五页，共六十四页，2022年，8月28日抗生素筛选第四十六页，共六十四页，2022年，8月28日

能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端,催化核苷酸的聚合作用,而不发生从引物模板上解离的情况.

常见的DNA聚合酶：最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）（DNA聚合酶；5’-3’外切核酸酶；3’-5’外切核酸酶）;大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，（没有5’-3’外切核酸酶的活性）；TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus;1976;Chien),能耐高温；pfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus),高保真性。DNA聚合酶第四十七页，共六十四页，2022年，8月28日DNA扩增PCR反应第四十八页，共六十四页，2022年，8月28日PCR的基本反应体系

（以DNA为模板的反应：

10×缓冲液10l

4种dNTP混合物

各200mol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2g

TaqDNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至100l

第四十九页，共六十四页，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶来自水生栖热菌Thermusaquaticus良好的耐热性Mg2+依赖性无校正功能PfuDNA聚合酶来自Pyrococcusfuriosus(激烈火球菌“Pfu”)纠错功能，高保真性第五十页，共六十四页，2022年，8月28日基因工程的常用载体：质粒载体λ噬菌体载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体真核细胞的克隆载体人工染色体噬菌粒载体第五十一页，共六十四页，2022年，8月28日一、质粒克隆载体a）低分子量有利于DNA的分离和操作；特点：b）具有较高拷贝数；c）易于导入细胞；d）具有安全性；质粒载体克隆外源DNA片段的大小一般不超过15Kb第五十二页，共六十四页，2022年，8月28日第五十三页，共六十四页，2022年，8月28日第五十四页，共六十四页，2022年，8月28日二、λ噬菌体克隆载体将野生型λ噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌体DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要基因区域进行改造。特点：1）它的分子遗传学背景十分清楚2）λ噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。而λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。3）具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100％，而质粒DNA的转化率却只有0.1％。4）和质粒相比，λ噬菌体具有更为狭窄的寄主范围，因此更加安全第五十五页，共六十四页，2022年，8月28日经过体外基因操作和包装后形成重组噬菌体，可以通过正常的感染途径进入宿主细胞；重组噬菌体DNA也可不经过体外包装而直接通过转染（转化）方式进入宿主细胞；第五十六页，共六十四页，2022年，8月28日质粒和噬菌体载体都可用于构建基因文库；但后者更有优势：容纳的外源DNA片段较大；以感染途径进入宿主细胞的效率比转化高；第五十七页，共六十四页，2022年，8月28日三、柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmidvector），又称粘粒，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。Cosmid(cossite-carryingplasmid)带有粘性末端位点(cos)的质粒第五十八页，共六十四页，2022年，8月28日特点：1）具有λ噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，高效地感染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照λ噬菌体DNA的方式环化，但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。2）具有质粒载体的特性：在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。3）具有高容量的克隆能力：柯斯质粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb.柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效，而这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。第五十九页，共六十四页，2022年，8月28日四、微生物作为克隆载体的宿主一、宿主的基本要求与性质①能够高效吸收外源DNA