常用的生化反应课件

实验四常用的生化反应实验目的认识染色方法鉴别细菌的局限性掌握几种常用生化反应的原理、方法和结果判断实验菌种产气肠杆菌（Enterobacterarogenes）大肠埃希菌（Escherichiacoli）普通变形杆菌（Proteusvulgaris）铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）O-F试验将实验菌种接种到2支O-F管中在其中1支管中加入无菌液体石蜡，厚度0.5cm左右。35℃培养18-24小时。结果开口管加石蜡管结果黄色黄色发酵型（F）黄色绿色氧化型（O）绿色蓝色产碱型VP试验

产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇被氧化（在碱性溶液中）生成二乙酰，后者可与含胍基的化合物反应生成红色化合物，称VP试验阳性。大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，VP阴性。

VP甲液：5%α－萘酚

VP乙液：40%KOH甲基红试验

产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性pH＜5.4，指示剂甲基红呈红色，称甲基红试验阳性。枸橼酸盐利用试验

能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，由此使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。吲哚试验（靛基质）

含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚（靛基质），若加入对二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验阳性。硫化氢试验

变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细菌。尿素分解试验

变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红色。

阳性阴性

尿素酶试验

吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为IMViC试验。大肠埃希菌呈“++--”，产气肠杆菌为“--++”。硝酸盐还原的过程因细菌不同而异:有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。试剂：甲液对氨基苯磺酸乙液α-奈胺结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原，试验阴性；②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成。

过氧化氢酶试验(触酶试验)原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。试剂：3％过氧化氢溶液。方法：取待测菌涂在玻片上，然后加3％过氧化氢数滴立即观察结果。结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。克氏双糖铁琼脂（KIA）

葡萄糖∶乳糖＝1∶10铁：枸橼酸铁铵指示剂：酚红我们人为的把高层代表葡萄糖，斜面代表乳糖。葡（－）葡（＋）葡（＋）葡（＋）乳（－）乳（＋）乳（－）H2S（＋）乳（－）

克氏双糖铁琼脂（KIA）高层

高层中丙酮酸浓度高，跟氧分子接触少，在24小时内不会被氧化，因此仍为黄色。结果高层－黄色斜面－红色如葡萄糖＋，乳糖＋，则高层与斜面均为黄色（24小时内）。如果延长培养时间，高层中的丙酮酸也会进一步氧化，同时细菌利用蛋白质后产碱性物质越来越多，则高层也会变为红色。有些细菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢

H2S＋Fe黑色的硫化亚铁问：有无葡萄糖－，乳糖＋的情况？为什么？MIU试验半固体M代表动力I代表吲哚（靛基质）U代表尿素结果观察时先观察有无动力，试验管有无变红（三分之二管变红为尿素阳性），然后加入对二甲基氨基苯甲醛，观察吲哚试验结果。思考题：KIA的试验原理实验内容1、用革兰染色法观察四种试验细菌的形态学特征2、将四种试验细菌