医学交流课件：酶工程制药

酶工程制药生物技术的四大支柱酶工程的应用酶在医疗保健方面的应用酶在食品工业中的应用酶在化工业中的应用酶在饲料工业中的应用酶在抗生素工业生产中的应用酶在环境保护中的应用酶在能源开发中的应用医用酶:酶来源用途淀粉酶、脂肪酶胰脏、麦芽、微生物消化不良、食欲不振溶菌酶蛋清、细菌止血、消炎、镇痛尿激酶人尿治疗心肌梗死、黄斑部出血青酶素酶腊状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态胶原酶细菌消炎、化脓、治疗溃疡溶纤酶蚯蚓溶血栓L-精氨酸酶、L-蛋氨酸酶微生物抗癌α-半乳糖苷酶牛肝、人胎盘治疗遗传缺陷病

酶工程在医疗上的应用药用酶:消化酶类,抗炎症类,心血管类,肿瘤用酶疾病诊断:酶活检测;分析试剂固定化酶制备药物:抗生素,氨基酸Pen-Gk苯乙酸钾+6-APA青霉素酰化酶氨苄西林阿莫西林制造人工肾等“人工脏器”人工肾——利用固定化脲酶、活性炭等一起制成体外循环装置。固定化脲酶由酶吸附于离子交换树脂上制成，与活性炭一起装入柱子，制成体外循环装置。尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢废物。

酶工程enzymeengineering——是酶学、微生物学与生物化工等学科有机结合而产生的新兴边缘学科，也是现代生物技术的重要组成。

特点：是一项利用酶、含酶细胞器或细胞作为生物催化剂来完成重要化学反应，并将相应底物转化成有用物质的应用型生物高新技术。定义酶的催化作用却很早就为人们的生活所利用。1897年以后，Bucher发现酶的细胞外作用现象。Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。1969年千烟一郎利用固定化酶工业化生产。20世纪90年代，基因工程的介入。酶工程的发展酶工程的三个里程碑：商品化酶制剂形成规模化生产固定化酶技术的发展和应用基因工程+发酵工艺+先进的发酵设备酶工程研究内容酶的生产酶的分离纯化酶的固定化酶生物反应器酶与酶固定化酶的应用酶的分离、提纯及大量生产酶和细胞的固定化酶反应器研究酶的分子改造与化学修饰有机相中酶反应的研究酶的抑制剂的开发及其应用研究模拟酶、合成酶的研究抗体酶、核酸酶的研究酶的定向进化技术

第一节:概述

酶的基础知识酶是具有催化活性和高度专一性的生物催化剂特点：催化效率高：比一般催化剂效率高107～1013倍高度专一：只催化某一类反应，只作用特定底物调节作用:催化作用在体内受到调节控制不稳定性：大多数酶本身是一种蛋白质，能使蛋白质变性的任何因素都能使酶失活；催化反应在温和调节下进行酶的化学特性本质是蛋白质酶的分子量很大酶由氨基酸组成酶具两性性质酶易变性失活单纯酶simpleenzyme和结合酶conjugatedenzyme

简单酶酶 结合酶 辅酶 Coenzyme辅因子 辅基 ProstheticgroupHoloenzymeApoenzymeCofactor辅助因子有金属离子和有机小分子两种有机小分子辅助因子根据与酶结合的紧密程度可分为：辅基：结合比较紧密辅酶：结合比较松弛，可透析去除根据化学本质的不同可将酶分为：蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）绝大部分的酶为蛋白类酶，其化学本质是蛋白质。两性电解质，在等电点易沉淀，在电场中能电泳导致蛋白变性的因素，都能使酶失活能被蛋白酶水解而失活酶的分类酶蛋白酶氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶核酸酶分子内催化酶:自我剪切酶自我剪接酶分子间催化酶:RNA剪切酶

DNA剪切酶多肽剪切酶多功能R酶其它R酶

酶是由生物体活细胞产生的生物催化剂，绝大多数酶的化学本质是蛋白质氧化还原酶类 Oxidoreductases转移酶类 Transferases水解酶类 Hydrolases裂合酶类 Lyases异构酶类 Isomerases合成酶类 Synthetases Synthases酶的来源和生产早期酶的生产主要以动植物为原料19世纪末20世纪初开始培养微生物产酶微生物种类繁多，酶品种齐全微生物生长周期短、繁殖快，酶产量高生产成本低培养条件简单微生物具较强的适应性和突变能力目前工业上得到的酶，绝大多数来自于微生物酶的生产方法提取法盐溶液提取酸溶液提取碱溶液提取有机溶剂提取生物合成法微生物细胞植物细胞动物细胞筛选诱变细胞融合、基因重组等方法获得优良的产物工程菌。在生物反应器培养，分离纯化化学合成方法缺点：成本高只能合成结构清楚的酶优势酶的人工模拟和化学修饰原料的选择微生物酶制剂的发酵酶的提取。酶的纯化酶生产的工艺过程产酶微生物的种类1、细菌大肠杆菌：青霉素酰化酶、溶菌酶枯草芽孢杆菌：淀粉酶、蛋白酶溶血性链球菌：链激酶2、放线菌链霉菌属：葡萄糖异构酶，溶菌酶，抗胰酶诺卡氏菌属：单加氧酶，双加氧酶3、酵母菌酿酒酵母：凝血激酶，尿激酶球拟酵母：青霉素酰化酶，谷氨酸脱羧酶4、霉菌根霉：淀粉糖化酶、脂肪酶、果胶酶毛霉：蛋白酶，淀粉糖化酶犁头酶：糖化酶，α-半乳糖苷酶曲霉：淀粉酶，蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶青霉：青霉素V酰化酶，葡萄糖氧化酶木霉：纤维素酶性质方法溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、溶剂萃取等电点离子交换层析、电泳电荷色谱聚焦、等电聚焦分子大小离心分离、凝胶过滤、透析过滤生物亲和性亲和层析、免疫吸附层析，亲和萃取疏水作用疏水层析、反相色谱酶的分离与纯化由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1．全部操作在低温0～4℃。2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。酶活力（enzymeactivity）酶催化某一化学反应的能力，用酶活力单位（U）表示1个酶活力单位（1U）:特定条件下,在1分钟内能转化1μmol底物的酶量或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量酶的比活力（specificactivity）即每毫克蛋白所具有的酶活力单位（U/mg蛋白质)比活力提高的倍数反映了纯化方法的有效程度对同一种酶来说，比活力愈高，表示酶愈强

分离纯化酶的一般程序粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳）浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥粗酶液的制备1、细胞破碎（机械、物理、化学、酶解）2、酶的抽提（酸碱、盐溶液、有机溶剂）细胞破碎的方法

1）机械破碎法组织捣碎法：使用高速组织捣碎器，捣碎过程中温度会迅速升高，故应注意冷却研磨法：一般使用匀浆器，可手动或马达驱动；也有用研钵与研杵进行手动研磨

通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞外层结构破坏，从而使细胞破碎的方法。2）物理破碎法超声破碎法：利用超声波（10-15KHz）产生空穴作用（cavitation），导致液体局部、瞬间的压力变化，而使细胞破裂。超声过程是个发热的过程，应保持样品低温，并注意冷却渗透压法：将细胞在高渗溶液中平衡一段时间后，突然转入低渗溶液中，细胞壁由于渗透压的突然变化而破碎。只适合细胞壁比较脆弱的细胞冻融法：将细胞在低温下（＜-15℃）冰冻后，再在室温下融化，反复多次。只适合胞壁易碎的细胞3）化学法溶剂处理法：脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合物，使细胞膜结构破坏表面活性剂处理法：表面活性剂能与磷脂及脂蛋白作用，破坏细胞膜结构4）酶解法自溶法：在一定pH和温度条件下，细胞自身酶类的作用而导致细胞壁的破碎外加酶法：使用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶，在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎2、酶的抽提（extraction）把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，以便进一步从中分离纯化1）酸、碱溶液提取2）盐溶液提取3）有机溶剂提取1）酸、碱溶液提取酶是蛋白质，具有等电点（PI）为了增加酶的溶解度，提取时pH应远离酶的等电点碱性蛋白酶用偏酸性缓冲液，酸性蛋白酶用偏碱性缓冲液2）盐溶液提取盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐可使电解质溶解度明显增加。0.05～0.2mol/LNaCl溶液3）有机溶剂提取一些与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶，需要用有机溶剂提取常用的有机溶剂有乙醇、丙酮和丁醇应尽快转入适当的缓冲液，并去除有机溶剂二、酶的主要分离技术原理：在转子高速转动所产生的离心力的驱动下，利用固体与液体之间的密度差进行分离优点：速度快，分离效率高缺点：设备投资大，能耗大1、离心分离2、沉淀分离原理：利用蛋白质在不同条件下的溶解度不同，通过某些方法使某些蛋白的溶解度降低，析出沉淀，再通过离心的方法将其与溶液中的其它蛋白分离等电点沉淀法盐析法有机溶剂法1）等电点沉淀法在pH值在等电点时，蛋白质所带的净电荷为零，具有最低的溶解度可以调节溶液的pH值，使目的酶从溶液中沉淀出来2）盐析法在高盐浓度时，蛋白质的溶解度会明显随溶液中离子浓度的增加而降低采用加入中性盐使各种蛋白质依次分别沉淀的方法最常用的盐析试剂是硫酸铵，溶解度大，价廉易得背景知识：蛋白质的盐溶和盐析

盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度

原理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子被此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高盐析：当离子强度增加到足够高时，如饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来

原理：大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子化的水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。

3）有机溶剂法与水相溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度降低利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法常用的有丙酮和乙醇3、膜分离用半透膜作为选择性障碍层，使溶液中某些组分通过，而截留其它组分的分离方法透析超滤1）透析（dialysis）透析是一种物理现象，用半透膜将液体分为两半，一边是原液，另一边是纯净溶剂（水或缓冲液）。原液中的大分子不能通过半透膜而被截留于膜内，可透析的小分子经扩散作用不断透过膜而相互渗透。多用于制备及提纯生物大分子时除去或更换小分子物质、脱盐和改变溶剂成分2）超滤通过外加高于溶液渗透压的压力，使溶液中的溶剂（一般是水）和小于膜孔径的溶质分子透过膜，浓缩溶液三、酶的主要纯化技术－层析技术利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数)，使各组分以不同的比例分布在两相中，当流动相以一定的速度流经固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离的技术过程。称为层析技术（chromatography）离子交换层析凝胶过滤层析疏水层析亲和层析1、离子交换层析（ionexchangechromatography）在一定的pH条件下，带电荷的蛋白质与高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团相吸附，流动相中解离的离子与被吸附的酶发生可逆的交换，而对不同吸附能力的蛋白质进行分离

阴离子蛋白质的离子交换层析原理

根据固定相偶联离子交换基团（官能团）所带电荷的不同可分为：阳离子交换树脂（带负电）和阴离子交换剂树脂（带正电）常用的固定相有纤维素、葡聚糖和琼脂糖基本策略离子交换剂的选择：阴离子交换剂用于处理净电荷为负的蛋白质，阳离子交换剂用于处理净电荷为正的蛋白质样品在低离子浓度条件下上柱，逐渐增加洗脱液的离子浓度，使蛋白依次被洗脱下来洗脱方式可以是步进式洗脱或线性梯度洗脱洗脱液一般用NaCl亦称分子筛层析、排阻层析，是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析分离的一种方法2、凝胶过滤法（gelfiltration）凝胶层析的原理

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；

凝胶过滤示意图基本原理凝胶装置图色谱峰和分离结果凝胶过滤介质的主要类型葡聚糖凝胶Sephadex琼脂糖凝胶Sepharose聚丙烯酰胺凝胶Bio-gel右旋糖酐/二聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl凝胶过滤的应用分离提纯脱盐测定高分子物质的相对分子量3、疏水层析（hydrophobicchromatography）原理：蛋白质分子中含有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等疏水性较强的氨基酸，当蛋白质溶液经过疏水层析介质的疏水配基时，蛋白的疏水性集团（疏水补丁）会与疏水配基发生亲和作用而被吸附在介质上。不同蛋白质分子中疏水基团的数量和特性有所不同。在洗脱时通过改变洗脱液的极性达到分离的目的L+HSLHS+WP：固相支持物L：疏水性配体S：蛋白质或多肽等生物大分子H：疏水补丁W：溶液中水分子P基本策略疏水介质的选择：一般选用苯基疏水介质，对于疏水性弱的蛋白质可选用辛基疏水介质，对于疏水性强的蛋白质可选用丁基或丙基疏水介质洗脱液：洗脱液极性越大，疏水介质的疏水吸附能力越大。一般采用高浓度盐溶液条件下将蛋白质样品上柱，然后逐渐降低洗脱液盐浓度，使蛋白质根据疏水性的大小依次被洗脱洗脱液的盐常用(NH4)2SO44、亲和层析（affinitychromatography）也称功能层析、生物专一吸附或选择层析。根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的方法酶与激活剂/抑制剂/底物/辅酶；抗原与抗体；激素/配体与受体；蛋白质与DNA/RNA上特定区域亲和层析纯化酶的原理特定的配基（激活剂/抑制剂/底物/辅酶）固定于惰性载体目的酶与配基特异性亲和吸附，杂质被洗脱改变洗脱条件，解除目的酶与配基的专一性结合亲和介质的制备

1）配基的选择2）载体的选择葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃琼脂糖凝胶纤维素3）手臂（spacerarm）载体本身没有活性基团，要先活化，引入手臂，再接配基常使用ω-氨烷基化合物四、酶的纯度鉴定技术SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)

凝胶制备：丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合，催化体系有两种：化学聚合：过硫酸铵（或过硫酸钾）＋N,N,N’,N’-四甲基已二胺（TEMED）光聚合：核黄素，可加TEMED加速聚合43K66.2K97.4K130K200KM123456MM：蛋白分子量标准1：菌体破壁抽提液2：硫酸铵沉淀3：Q-sepharose层析洗脱液4：phenyl-sepharose层析洗脱液5：羟基磷灰石层析洗脱液6：sepharylS-300层析洗脱液游离酶的缺点：稳定性差、易失活。不能重复使用，成本高。不能与产物分离，酶反应后分离纯化困难。酶的固定化技术通过各种方法（吸附、结合、包埋等）能够有效地对酶进行修饰，改善酶的化学稳定性，并可重复使用第三节酶与细胞的固定化什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术一、固定化酶（细胞）的定义一、固定化酶（细胞）的定义

优点：1.稳定性显著提高；2.同一批固定化酶能重复多次地使用；3.固定化后，很容易与反应物分开（过滤），不污染产物，而且有利于控制生产过程，同时也省去了热处理等使酶失活的步骤；4.可长期使用，并可预测衰变的速度；5.提供了研究酶动力学的良好模型。

缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活二、酶固定化方法

载体结合法

物理吸附法离子结合法共价结合法交联法包埋法网格型微囊型

酶固定化关键在于选择合适的载体和适当的固定化方法1、载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。1）物理吸附法作用方式：非特异性物理吸附作用：范德华力；氢键；疏水作用；静电作用优点：制作简单，酶分子的构象很少或基本不发生变化，固定化酶活力较高缺点：酶与载体结合力弱，酶易从载体脱落载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等2）离子结合法作用方式：离子键结合优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较高的固定化酶。缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应时，酶与载体易分开。载体：多糖类离子交换剂，合成高分子离子交换树脂3）共价结合法作用方式：共价键结合优点：酶分子和载体间的共价键较牢固，有良好的稳定性及重复使用性缺点：制备过程复杂，反应条件比较剧烈，酶活性损失比较严重。制作方法：先将载体活化，在载体上引入一个活化基团，然后该活化基团再与酶分子表面的基团（羧基/氨基/羟基）反应结合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。2、交联法利用双功能（或多功能）基团的试剂，使酶蛋白分子之间发生交联，凝集成网状结构而成为固定化酶常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛双功能试剂：

常用的是戊二醛

O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶相同：利用共价键结合不同：交联法不使用载体交联法与共价结合法的异同点：（a）酶分子之间用交联法结合成固定化酶；（b）酶分子与载体以共价结合法结合得到的固定化酶3、包埋法将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。载体：凝胶，高分子聚合物（半透膜）

优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化。

缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发生催化作用。所以用包埋法制备的酶，一般只适用与小分子底物。

包埋法分为：网格包埋法和微囊包埋法。

1）网格型将酶包埋于高分子凝胶细微网格中材料：海藻胶、明胶等天然高分子化合物；聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等合成高分子化合物微囊型将酶包埋在半透性聚合体膜内，形成的直径为1~100um。颗粒比网格型小的多，利于底物的扩散制备成本高各种固定化酶方法的优缺点比较

固定化酶的制备原则①注意维持酶的催化活性及专一性。在酶的固定化过程中，酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。②固定化应该有利于生产自动化、