黄牛和水牛源性成分同步检测方法实时荧光PCR法编制说明

编制说明项目名称： 黄牛和水牛源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法项目编号： 内质监标函〔2018〕307号编制单位： 锡林郭勒职业学院一、工作简况本项目来源于2018年第3批内蒙古自治区地方标准制修订项目（内质监标函〔2018〕307号）。起草单位为锡林郭勒职业学院，协作单位为锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心。主要起草人：郭梁、李春冬、郭元晟、徐伟良、刘国强、罗建兴。二、制定标准的必要性和意义水牛乳产量虽然较低，但奶中所含蛋白质、脂肪，乳脂、维生素、微量元素等均高于牛奶，含有适宜儿童生长发育和抗衰老的锌、铁、钙。作为一类高级营养食品，水牛乳制品日渐成人们消费的“新宠”。市场中存在用低价牛奶冒充高价水牛奶的欺诈违法行为。目前，已经存在一项水牛源性检测方法标准：食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分：水牛成分检测实时荧PCR法（SN/T3730.7-2013）。在采用上述检测标准后发现：目前缺乏基于同管质量控制体系、针对肉乳制品的黄牛和水牛源性成分同步检测方法的相关标准。本标准是基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的黄牛和水牛源性成分同步检测方法的相关标准，具有快速、高通量以及去除假阴性等特征。三、主要起草过程本标准制定工作从2018年10月开始，组织成立了标准起草团队。起草团队首先进行相关标准、专利以及论文的收集和整理工作，制定了基于多重实时荧光 PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的动物源性成分检测标准体系的研发目标，计划形成黄牛Bostaurus）、水牛（Bubalusbubalis）、马（Equuscaballus）、山羊Caprahircus）、绵羊（Ovisaries）、牦牛（Bosgrunniens）、猪Susscrofa）、驴（Equusasinus）、双峰驼（Camelusbactrianus）、梅花鹿（Cervusnippon）、鸡（Gallusgallus）、鸭（Anasplatyrhynchos）及鹅（Anseranser）等13个物种、针对肉（鲜肉、肉干及香肠）和乳（鲜乳、发酵乳、乳酪及乳粉）的常见动物源性成分检测标准体系。具体实验过程如下：（一） 在NCBI中下载不同物种（黄牛、水牛、马、山羊、绵羊、牦牛、猪、驴、双峰驼、梅花鹿、鸡、鸭及鹅等 13个物种）的线粒体序列。为了保证引物和探针的物种适用性，每个物种下载5-20个品种或品系的线粒体序列；利用生物信息学软件（ClustalX或MAGE5）对所下载的线粒体序列进行比对。筛选物种间特异品种间保守的序列为目标靶向区域（5-10个），针对目标靶向区域设计5组引物和探针组合。上游引物的3’端距离探针的5’端为1-20bp，探针的5’端避免出现G，探针Tm要高于引物Tm值10℃左右；不同物种的探针用不同的荧光基团标记FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探针Tm值和引物Tm值接近，探针3’端可以选择MGB基团；（二） 收集各种来源于不同动物的肉（鲜肉、肉干及香肠）和乳（鲜乳、发酵乳、乳酪及乳粉）。利用改良CTAB法提取样品的DNA（A260nm/A280nm≈1，.8琼脂糖凝胶电泳主带无拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性较高）；（三） 特异性分析：利用实时荧光 PCR对5组引物和探针进行检测，有典型扩增曲线且 Ct值≤35计为检出。在阳性对照检出、阴性对照未检出、对 5组引物和探针进行特异性的分析评价。反应体系（20μL）：TransStartProbeqPCRSuperMix10 （μL北京全式金生物技术有限公司），引物各1μL，探针各0.5μL，模板DNA1μL，补水至20μL。反应条件：94℃、30s，1个循环；94℃、5s，60℃、31s，40个循环；（四） 绝对灵敏度分析：以来源于不同肉乳制品的高质量 DNA为模板母液，用灭菌 ddH2O稀释模板母液，共稀释 10个梯度，稀释后质量浓度分别为 100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001ng/。μL以不同稀释浓度的DNA为模板对5组引物和探针进行检测，根据PCR反应的Ct值分析此方法对于不同浓度模板DNA的检测灵敏度。检出限（LOD）统计分析参照Probitanalysis。比较5组引物和探针的绝对灵敏度，分析引物和探针的特异性和保守性与绝对灵敏度之间的相关性；（五） 掺假检出限（相对灵敏度）分析：首先，制备模拟掺假混合样品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述掺假组为模板对 5组引物和探针进行检测，根据 PCR反应的Ct值分析此方法对于不同浓度掺假的掺假检出限。检出限LOD）统计分析参照Probitanalysis。比较5组引物和探针的掺假检出限（相对灵敏度），分析引物和探针的特异性和保守性与掺假检出限之间的相关性；（六） 定量分析：以模板质量浓度和掺假浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，构建绝对定量标准曲线和掺假定量标准曲线，分析引物和探针的特异性和保守性与扩增效率和相关系数的相关性；利用已知浓度的盲样验证定量标准曲线的适用性，通过扩增效率（90%-110%）、相关系数R2（≥0.99）以及回收率（90%-110%）评价5组引物和探针的定量分析能力，分析引物和探针的特异性和保守性与定量分析能力之间的关系；（七）相关数据已经进行论文投稿以及专利申请。目前发表SCI论文2篇，在投稿SCI论文3篇，中文核心论文8篇，申请国家发明专利8项（授权1项）。最终通过上述实验确定黄牛和水牛源性成分同步检测的引物和探针以及绝对灵敏度（1pg）和相对灵敏度（0.1-1%）。此方法具有黄牛和水牛源性的特异性，来源于黄牛和水牛的肉乳样品均出现相应探