第六章核酸的研究技术

第六章核酸的研究技术演示文稿第一页，共一百零二页。（优选）第六章核酸的研究技术第二页，共一百零二页。第三页，共一百零二页。解链温度（融解温度，Tm）

(meltingtemperature)：

使50%的DNA发生变性时的环境温度。

DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。第四页，共一百零二页。第五页，共一百零二页。增色效应：

DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。第六页，共一百零二页。DNA的复性（renaturation)：

在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。第七页，共一百零二页。第八页，共一百零二页。减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。第九页，共一百零二页。1.常用的变性方法：

①热变性

②酸碱变性

③化学试剂变性

第十页，共一百零二页。2.影响复性的因素

①序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快②DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢③离子强度↑→有利于复性④DNA浓度↑→复性↑

Tm值的估算①<20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②>20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）

第十一页，共一百零二页。核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。++第十二页，共一百零二页。第十三页，共一百零二页。第十四页，共一百零二页。二、影响杂交的因素

1.核酸分子的浓度和长度

2.温度：比Tm低25℃~30℃较适宜3.离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑

第十五页，共一百零二页。

4.杂交液中的甲酰胺

甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42℃。使用甲酰胺的优点：

①低温下探针更稳定；②能更好地保留非共价结合的核酸。第十六页，共一百零二页。注意：①待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交，用水溶液时取68℃，用50%甲酰胺溶液时取40℃。②待测核酸顺序与探针同源性不高时，以50%甲酰胺溶液在35—40℃杂交。第十七页，共一百零二页。5.核酸分子的复杂性直接影响复性几率。6.非特异性杂交反应：在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。常用封闭物：①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液 脱脂奶粉

第十八页，共一百零二页。三、核酸探针

（一）探针的选择原则

1.高度的特异性

2.制备探针的难易性和检测手段的灵敏法

（二）探针的种类

第十九页，共一百零二页。1.基因组DNA探针从基因组DNA文库中选取某一基因片段

↓

与载体连接（质粒、噬菌体）↓克隆(PCR扩增)↓酶切优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解（与RNA比较）；③标记方法成熟。

第二十页，共一百零二页。2.cDNA探针（complementaryDNA）

↓S1核酸酶切平两端优点：不含内含子及高度重复序列但不易获得↓载体连接↓克隆通过逆转录↓双链cDNA加接头 ↓限制酶粘性末端第二十一页，共一百零二页。3.RNA探针：检测DNA和mRNA

优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。

缺点：易降解，标记方法复杂

第二十二页，共一百零二页。4.寡核苷酸探针

优点：①可根据需要合成相应序列； ②探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; ③长度只有10—50bp，该识别序 列内1个碱基的变化可明显降低杂 交Tm值。 ④可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。

第二十三页，共一百零二页。（三）探针设计原则：

①长度：10~50bp②碱基成分:G+C含量为40%~60%

③探针分子内无互补序列。④避免同一碱基重复出现。⑤一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。第二十四页，共一百零二页。（四）探针标记物的选择

理想的标记物：

①具有高度的灵敏性②与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性③检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；④若用酶促方法标记，应对Km影响不大第二十五页，共一百零二页。常用的放射性标记物

常用探记探针的同位素：

32P、3H、35S、14C、125I、131I第二十六页，共一百零二页。2.特性：

①检测特异性强；②灵敏度高；③对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；④易造成放射性污染；⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。第二十七页，共一百零二页。3.探针标记的方法

①缺口平移法（nicktranslation）实质：用[α-32P]dNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。第二十八页，共一百零二页。第二十九页，共一百零二页。②随机引物法（randompriming）人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物，它们可以随机地互补到DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即可形成放射性同位素标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。优点：比活度高，结果稳定第三十页，共一百零二页。第三十一页，共一百零二页。③用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端

5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ

碱性磷酸酶(AKP）

5ˊ-HOCpGpApCpG-3ˊ

[γ-32P]ATPT4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）

5ˊ-32PCpGpApCpG-3ˊ

第三十二页，共一百零二页。④Klenow片段快速标记DNA探针末端

用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链

N——C5ˊ→3ˊ外切酶

3ˊ→5ˊ外切酶

5ˊ→3ˊ聚合酶

小片段(36000) Klenow片段（67000）

3′—CTTAAG—5′5′—GAATTC—3′EcoRⅠ

5′——G AATTC——3′

3′——CTTAA G——5′

Klenow,dNTP,[α-32P]dATP

5ˊ——GAATTAATTC——3ˊ

3ˊ——CTTAATTAAG——5

第三十三页，共一百零二页。常用的非放射性标记

优点：无环境污染，可较长时间贮存方法：1.酶标记法

2.化学标记法要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylominofluorene）第三十四页，共一百零二页。1.生物素标记核酸探针Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。2.地高辛（Dig）标记核酸探针第三十五页，共一百零二页。第三十六页，共一百零二页。第三十七页，共一百零二页。第三十八页，共一百零二页。第三十九页，共一百零二页。第四十页，共一百零二页。四、核酸分子杂交技术

（一）类型：根据反应环境分为1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定 在固体支持物上，另一条核酸 链游离在液体中。2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游 离在液体中。第四十一页，共一百零二页。（二）固体支持物种类硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板等。选择原则：①具有较强的结合核酸的能力；②与核酸的结合比较稳定③尽量少的非特异性吸附第四十二页，共一百零二页。（三）常用固相杂交类型Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。第四十三页，共一百零二页。1.Southern印迹杂交主要步骤：第四十四页，共一百零二页。纯化的待测DNA样品

琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段

凝胶上DNA变性

中和

DNA转印至NC膜

预杂交

限制性内切酶酶切后（EDTA，65℃灭活限制酶）

变性液（碱变性）

Tris缓冲液

高盐下

烘干、固定

杂交

放射自显影

结果分析

第四十五页，共一百零二页。第四十六页，共一百零二页。southern印迹载体凝胶吸水纸缓冲液滤纸固定到载体第四十七页，共一百零二页。2.Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblotting。3.斑点杂交（dotblot）(线状圆形)第四十八页，共一百零二页。4.原位杂交（insituhybridization）直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。应用：1）观察基因在组织中的表达

2）确定基因在染色体中的定位第四十九页，共一百零二页。5.菌落原位杂交（colonysituhybridization）将细菌从平板转移到NC膜上

裂解细菌释出DNA

烘干

杂交

第五十页，共一百零二页。（四）核酸杂交的应用在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。

1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血的检验

2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定3、癌基因点突变分析4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定第五十一页，共一百零二页。附：蛋白免疫杂交（一）蛋白质的免疫印迹（western)场所：硝酸纤维素膜待检分子：蛋白探针：抗体杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白。第五十二页，共一百零二页。（二）所用抗体1、一抗：针对待测分子的抗体2、二抗：针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素第五十三页，共一百零二页。（三）操作过程蛋白的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质第五十四页，共一百零二页。蛋白印迹封闭+阳极-阴极多孔垫片滤纸凝胶载体第五十五页，共一百零二页。杂交（一抗与特定蛋白结合）漂洗去除多余的一抗二抗与一抗结合漂洗去多余的二抗结果检测第五十六页，共一百零二页。第二节核酸的测序技术第五十七页，共一百零二页。一、Sanger双脱氧终止法

(chain-terminatormethod)第五十八页，共一百零二页。原理

在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。第五十九页，共一百零二页。Sanger双脱氧链终止法第六十页，共一百零二页。1.双脱氧终止法测序反应体系包括：DNA聚合酶单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)第六十一页，共一百零二页。2.Sanger法DNA测序的试剂①引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构②模板③DNA聚合酶④2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（2′,3′-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP

）⑤dNTP第六十二页，共一百零二页。3.测序反应的种类①引物标记法(Dyeprimerreactions)②终止物标记法(Dyeterminatorreactions)第六十三页，共一百零二页。Dyeprimerreactions-fluorescentdye(label)ontheprimer,onespecificdyeforeachnucleotidetobeidentified(A,C.G,T)-fourseparatereactionscoupleeachspecificprimerwiththecorrespondingddNTP第六十四页，共一百零二页。Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.

第六十五页，共一百零二页。Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencinggel.NoticethatthesequenceofthestrandofDNAcomplementarytothesequencedstrandis5'to3'ACGCCCGAGTAGCCCAGATTwhilethesequenceofthesequencedstrand,5'to3',isAATCTGGGCTACTCGGGCGT

第六十六页，共一百零二页。第六十七页，共一百零二页。Dyeterminatorreactions-theprimerisnotlabeledwithadye-thedyeisattachedtothedideoxynucleotide,sowheneveraddNTPisaddedbythepolymerase,thefragmentislabeledaccordingtotheddNTPattheend-sincelabelingoccurswiththeadditionoftheddNTP,onlyonereactionpertemplateisneeded第六十八页，共一百零二页。第六十九页，共一百零二页。第七十页，共一百零二页。第七十一页，共一百零二页。第七十二页，共一百零二页。第七十三页，共一百零二页。二、Maxam-Gilbert化学修饰法

(chemicalcleavagemethod)一、原理AsegmentofDNAislabeledatoneendwith32P.ThelabeledDNAisdividedintofoursamplesandeachsampleistreatedwithachemicalthatspecificallydestroysoneortwoofthefourbasesintheDNA.TheconditionsofthereactionarecontrolledsothatonlyafewsitesarenickedinanyoneDNAmolecule.Whenthesenickedmoleculesaretreatedwithpiperidine,theDNAbackbonesisbrokenatthesiteatwhichthebasehadbeendestroyed.Thisgeneratesaseriesoflabeledfragments,thelengthofwhichdependonthedistanceofthedestroyedbasefromthelabeledend.ThesetsoflabeledfragmentsobtainedfromeachofthefourreactionsarerunsidebysideonanacrylamidegelthatseparatesDNAfragmentsaccordingtosize.第七十四页，共一百零二页。原理

一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。因此生成4种放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。第七十五页，共一百零二页。基本步骤

第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰；第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯键断裂；第三步，比较G、A+G、C+T、C和A>C各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读取DNA序列。第七十六页，共一百零二页。DNA化学裂解反应体系反应体系修饰试剂修饰反应链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯（DMS）G甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）C六氢吡啶C第七十七页，共一百零二页。Maxam-Gilbert化学修饰法第七十八页，共一百零二页。特点重现性好，所用试剂简单，易于掌握；所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好；序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝；可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结构及蛋白质-DNA相互作用。第七十九页，共一百零二页。无需延伸反应及克隆更适于含有稀有碱基或GC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并测序。比较繁琐费时，过长序列有困难。

第八十页，共一百零二页。第八十一页，共一百零二页。第八十二页，共一百零二页。第八十三页，共一百零二页。三、DNA测序的自动化和大规模测序①

文库构建②转化③培养④模板制备⑤电泳检测模板⑥测序反应⑦毛细管电泳测序⑧数据收集处理第八十四页，共一百零二页。第八十五页，共一百零二页。

第三节PCR技术

第八十六页，共一百零二页。

多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

第八十七页，共一百零二页。基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增第八十八页，共一百零二页。PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第八十九页，共一百零二页。KaryB.Mullis（1944－）第九十页，共一百零二页。三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermo